馬延娜， 薛 靜， 徐搖光， 張曉東*

1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)院，北京100037；

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097

植物化學(xué)誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展

馬延娜1，2， 薛 靜2， 徐搖光2， 張曉東2*

1.首都師范大學(xué)生命科學(xué)院，北京100037；

2.北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京100097

隨著植物基因工程的發(fā)展，植物的化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)受到越來越多的重視。化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)通常包含兩個(gè)元件，第一個(gè)元件多為一個(gè)嵌合的轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性的結(jié)合到啟動(dòng)子上；第二個(gè)元件具有前面的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，從而控制目的基因的表達(dá)。本文綜述了當(dāng)前廣泛應(yīng)用的一元誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)，如四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，和二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，包括：乙醇誘導(dǎo)、地塞米松誘導(dǎo)、β2雌激素誘導(dǎo)和熱休克誘導(dǎo)等不同系統(tǒng)，總結(jié)了各化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展及其潛在利用的可行性。

化學(xué)誘導(dǎo)；激活子；效應(yīng)因子；一元基因盒；二元基因盒

目前大規(guī)模商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中廣泛應(yīng)用的啟動(dòng)子多是組成型啟動(dòng)子，例如雙子葉植物中常用的來自花椰菜花葉病毒（CaMV）的35S啟動(dòng)子和來自農(nóng)桿菌的胭脂堿合酶（Nos）啟動(dòng)子，單子葉植物中經(jīng)常應(yīng)用的水稻肌動(dòng)蛋白-1（Rac1）啟動(dòng)子以及玉米泛素-1（Ubi-1）啟動(dòng)子等［1～3］。

隨著植物基因工程的發(fā)展，用特異性啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子，對(duì)外源基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控，使其在植物體內(nèi)適時(shí)、適量地表達(dá)，顯得尤為重要。組織特異性啟動(dòng)子調(diào)控基因只在某些特定組織或器官中轉(zhuǎn)錄，對(duì)于闡明植物生長(zhǎng)發(fā)育、代謝途徑等非常重要，具有很好的應(yīng)用前景。與組織特異性啟動(dòng)子相比，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子有著獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，可根據(jù)需要，在植物的特定發(fā)育階段、特異的組織器官或特定生長(zhǎng)環(huán)境下，施加誘導(dǎo)信號(hào)，誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)；也可解除脅迫，讓目的基因的表達(dá)停止。這種快速、定點(diǎn)誘導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)錄的“開”與“關(guān)”，可真正實(shí)現(xiàn)外源基因的精確調(diào)控。在各類誘導(dǎo)型啟動(dòng)子中，化學(xué)誘導(dǎo)系統(tǒng)由于可控性強(qiáng)，應(yīng)用最為廣泛。

化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)通常包含兩個(gè)元件，第一個(gè)元件多為一個(gè)嵌合的轉(zhuǎn)錄因子，可以特異性的結(jié)合到某些基因的啟動(dòng)子上。這個(gè)嵌合的轉(zhuǎn)錄因子只有在受到誘導(dǎo)后才能激活下游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，通常稱之為激活子；第二個(gè)元件具有前面的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，通常稱這個(gè)元件為效應(yīng)因子。效應(yīng)因子的兩端通常會(huì)有一個(gè)組成型表達(dá)的mini35S啟動(dòng)子，從而能夠保證一個(gè)最基本的轉(zhuǎn)錄機(jī)制，但是要通過內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄激活子將它的激活活性降到最低。激活子和效應(yīng)因子可以同時(shí)在一個(gè)基因盒中，為一元的基因盒表達(dá)系統(tǒng)；也可以分別位于不同的載體上，為多元基因盒表達(dá)系統(tǒng)，應(yīng)用較多的多為二元基因盒誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)［4］。

通過化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的去阻遏、失活和激活。對(duì)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的去阻遏系統(tǒng)研究和應(yīng)用較多的主要是基于四環(huán)素受體的去阻遏誘導(dǎo)系統(tǒng)，基于四環(huán)素受體還構(gòu)建有失活基因表達(dá)系統(tǒng)。基于目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄激活的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在植物中研究最多，也應(yīng)用最為廣泛，包括：基于糖皮質(zhì)激素受體的可誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)、基于糖皮質(zhì)激素受體和四環(huán)素抑制因子的雙向誘導(dǎo)基因表達(dá)系統(tǒng)、基于雌激素受體的甾類激素誘導(dǎo)的表達(dá)系統(tǒng)和基于蛻皮激素受體的殺蟲劑誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)等。這些誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的原理及應(yīng)用在前人的研究中已得到詳細(xì)的介紹［5～7］。本文主要討論植物化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展及其潛在利用的可行性。

1 一元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

目前四環(huán)素被廣泛用于人工構(gòu)建的基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過四環(huán)素結(jié)合到四環(huán)素受體上來調(diào)控目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄。由于四環(huán)素的誘導(dǎo)效率依賴于四環(huán)素受體的濃度，且高濃度的四環(huán)素對(duì)所誘導(dǎo)的植物是有害的，而植物中四環(huán)素受體濃度有限，使得四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用也受到極大的限制，因此發(fā)展新的四環(huán)素衍生物對(duì)于提高基于四環(huán)素受體的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍具有重大意義。目前，對(duì)四環(huán)素衍生物的研究越來越受到重視，并已經(jīng)開發(fā)出上千種四環(huán)素衍生物，但是其中只有少數(shù)可以被利用［8］。Aleksan

drov等［9］利用熒光實(shí)驗(yàn)和自由能分子動(dòng)力學(xué)模擬實(shí)驗(yàn)分別對(duì)四環(huán)素及15種四環(huán)素衍生物與四環(huán)素受體的結(jié)合特異性進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)在某些位點(diǎn)具有疏水基團(tuán)的四環(huán)素衍生物能夠促進(jìn)其結(jié)合到四環(huán)素受體上。4-二甲氨基類的四環(huán)素衍生物相比于含疏水基團(tuán)的四環(huán)素衍生物具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用，能夠極大地提高同四環(huán)素受體的結(jié)合效率，從而在較低濃度條件下就能達(dá)到較好的誘導(dǎo)效果。

別構(gòu)效應(yīng)在化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，如在基于四環(huán)素受體的誘導(dǎo)系統(tǒng)中，在無誘導(dǎo)劑時(shí)四環(huán)素受體為一種構(gòu)象，在誘導(dǎo)劑出現(xiàn)后通過變構(gòu)效應(yīng)，轉(zhuǎn)變成為可與DNA結(jié)合的構(gòu)象［10］。在四環(huán)素的替代物的研究方面，除了構(gòu)建新的四環(huán)素衍生物之外，Goeke等［11］發(fā)現(xiàn)一些短鏈的活性肽也可以作為四環(huán)素受體的誘導(dǎo)劑、反誘導(dǎo)劑或者輔阻遏物。這些活性肽可以持續(xù)地結(jié)合在四環(huán)素受體的四環(huán)素結(jié)合位點(diǎn)，顯著地引發(fā)四環(huán)素受體的別構(gòu)行為繼而引起誘導(dǎo)、失活或者阻遏效應(yīng)。更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)基因表達(dá)和誘導(dǎo)基因失活的活性肽是分別結(jié)合在四環(huán)素受體的不同位置，分別進(jìn)行各自的調(diào)控反應(yīng)。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的工作原理主要是基于蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，因此這些活性肽的發(fā)現(xiàn)無疑對(duì)蛋白質(zhì)介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)產(chǎn)生重大的影響，對(duì)于我們更加深入的研究和應(yīng)用化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有深遠(yuǎn)的意義。

2 二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

大多數(shù)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為單一的盒式系統(tǒng)，雖然這些系統(tǒng)已經(jīng)在一定程度上加快了轉(zhuǎn)化過程，但是二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)為載體整合到植物基因組中后進(jìn)一步驗(yàn)證系統(tǒng)的功能提供了可能。二元誘導(dǎo)系統(tǒng)可以通過優(yōu)化選擇不同功能激活子和效應(yīng)因子的組合而避免不希望出現(xiàn)的副作用。這些組合通過相互交換組合，從而獲得一個(gè)完全的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。此外，二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)能夠通過不同的激活子和效應(yīng)因子組合來確保多種功能的實(shí)現(xiàn)，通過不同的組合易于篩選出只限于特定組織或者可以耐受多重效應(yīng)因子的誘導(dǎo)表達(dá)組合。

2.1 乙醇誘導(dǎo)的基于AlcR／AlcA的基因表達(dá)系統(tǒng)

AlcR轉(zhuǎn)錄因子（激活子）和AlcA啟動(dòng)子（啟動(dòng)目的基因表達(dá)）是從Aspergillus nidulans中分離出來的［12～14］。在這個(gè)系統(tǒng)中AlcR轉(zhuǎn)錄因子受乙醛誘導(dǎo)激活，乙醛是植物中的乙醇代謝途徑中產(chǎn)生的。在擬南芥中AlcA啟動(dòng)子不能被內(nèi)源的轉(zhuǎn)錄因子激活，即使是在厭氧條件下也不能夠激活［13］。在這個(gè)系統(tǒng)中，激活子和啟動(dòng)子分別位于兩個(gè)不同的植物轉(zhuǎn)化載體上。這個(gè)系統(tǒng)非常適合利用脈沖進(jìn)行誘導(dǎo)或者進(jìn)行局部誘導(dǎo)，因?yàn)槔锰禺惖膯?dòng)子和乙醇快速蒸發(fā)的性質(zhì)可以對(duì)AlcR的表達(dá)進(jìn)行精確的調(diào)控，使其以精確的模式發(fā)揮作用［15，16］。但是由于乙醇對(duì)植物的毒性作用，脈沖誘導(dǎo)必須進(jìn)行仔細(xì)校準(zhǔn)以確保在最短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大的誘導(dǎo)效應(yīng)。

2.2 地塞米松誘導(dǎo)的基于融合糖皮質(zhì)激素受體、GVG／UAS或者pOp／LhGR誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

這三種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)都是基于糖皮質(zhì)激素受體（GR）的配體結(jié)合域的反應(yīng)特性而構(gòu)建的［17］。該結(jié)構(gòu)域含有93個(gè)氨基酸，在沒有甾類激素存在時(shí)，GR同細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的熱休克蛋白HSP90相互作用，而轉(zhuǎn)錄因子與GR的結(jié)合是沒有激活活性的，由于它們同HSP90結(jié)合錨定在細(xì)胞質(zhì)中，因此不能進(jìn)入到細(xì)胞核中［18］。但是在經(jīng)過人工合成的甾類激素地塞米松的處理后，GR-HSP90之間的相互作用就被中斷，釋放出HSP90，從而使GR-轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體可以進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核中，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并激活目的基因的表達(dá)。該系統(tǒng)的優(yōu)越性在于糖皮質(zhì)激素受體結(jié)構(gòu)域可以直接與目標(biāo)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合［19，20］。

如果目標(biāo)基因不是轉(zhuǎn)錄因子，還可以利用含有GR結(jié)構(gòu)域的融合轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行誘導(dǎo)，GVG／UAS就屬于這類誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。GVG激活子含有一個(gè)酵母菌Gal4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、來自皰疹病毒的強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活子VP16和GR受體［21］。目的基因的復(fù)制受到位于上游的一個(gè)激活序列（UAS）的調(diào)控。該系統(tǒng)現(xiàn)已成功應(yīng)用，但是誘導(dǎo)產(chǎn)物需要小心謹(jǐn)慎地進(jìn)行處理，在擬南芥和若干其他植物的應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)水平的GVG會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的生長(zhǎng)發(fā)育缺陷甚至死亡［22～28］。

另一種基于糖皮質(zhì)激素受體的二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)pOp／LhGR的激活子LhGR包括一個(gè)同大腸桿菌lac受體具有較高親緣性的突變體，這個(gè)突變體同酵母菌的Gal4轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，并同GR結(jié)合［29］。目的基因可以通過下6個(gè)拷貝數(shù)的lac操作子進(jìn)行復(fù)制。這個(gè)系統(tǒng)相較于前兩個(gè)系統(tǒng)有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，它既可以利用一元基因盒模式也可以通過二元模式高效、快速地進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，到目前為止的報(bào)道中均未發(fā)現(xiàn)副作用，該系統(tǒng)通過優(yōu)化已成功應(yīng)用于煙草中［30～33］。

2.3 β2雌激素誘導(dǎo)的XVE／OlexA基因表達(dá)系統(tǒng)

XVE激活子含有一個(gè)lexA受體結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域同VP16轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和人雌激素受體ER融合［34］。當(dāng)向系統(tǒng)提供雌激素如17β-雌二醇時(shí)，XVE激活子結(jié)合到8個(gè)拷貝數(shù)的lexA結(jié)構(gòu)域上，進(jìn)而激活下游目的基因的轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中植物雌激素不能激活該系統(tǒng)，但是相關(guān)報(bào)道指出在大豆的種子中高濃度的植物雌激素可以使這個(gè)系統(tǒng)非特異性的激活［35］。但是對(duì)于外源的雌激素如β-雌二醇，在高達(dá)25μmol／L的濃度條件下既不會(huì)對(duì)擬南芥的生長(zhǎng)發(fā)育過程產(chǎn)生影響，也不會(huì)對(duì)內(nèi)源基因的表達(dá)產(chǎn)生影響［36］。因此這就大大擴(kuò)展了這個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的使用范圍。

2.4 熱休克誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)

來自于擬南芥的熱休克蛋白18.2（HSP18.2）基因［37］的啟動(dòng)子在某些植物中已經(jīng)被成功用于在熱休克之后誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)［38～40］。在沒有熱休克處理時(shí)，HSP18.2的啟動(dòng)子是處于抑制狀態(tài)的［41］。轉(zhuǎn)基因植株在經(jīng)過37℃的熱休克處理后，通過反向激活啟動(dòng)下游目的基因的轉(zhuǎn)錄復(fù)制。

3 總結(jié)與展望

近年來關(guān)于化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用研究非常廣泛，根據(jù)各類誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的作用機(jī)理將其簡(jiǎn)單分為一元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)兩大類。每種類型的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)都各有其優(yōu)點(diǎn)和不足，必須根據(jù)所要誘導(dǎo)的目的基因及研究植物種類的不同選擇合適的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，并通過優(yōu)化各種反應(yīng)條件，從而達(dá)到預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。

化學(xué)可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)精確控制外源基因的表達(dá)，因此在基因工程應(yīng)用之中具有優(yōu)勢(shì)，國(guó)內(nèi)外研究者也對(duì)此進(jìn)行了不斷的研究，針對(duì)已有的成熟的誘導(dǎo)系統(tǒng)進(jìn)行改造，或開發(fā)新的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。無論是一元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)還是二元誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，都可以通過進(jìn)一步改造配體結(jié)構(gòu)域，使用不同的激活劑、優(yōu)化DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，優(yōu)化使用最小的啟動(dòng)子及啟動(dòng)子應(yīng)答元件序列等手段，最終達(dá)到降低背景表達(dá)量，提高誘導(dǎo)表達(dá)效率的目的。

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The Development of Chem ical Induced Gene Expression System in Plants

Ma Yan-na1，2，XUE Jing2，Xu Yao-guang2，ZHANG Xiao-dong2*
1.Collage of Life Science，Capital Normal University，Beijing 100037，China；
2.Beijing Agricultural Biotechnology Research Center，Beijing Academy of Agriculture and Forestry Science，Beijing 100097，China

With the development of plantgenetic engineering，the application of plant chemical induced gene expression system is becomingmore and more important.Chemical induced gene expression system typically consists of two components，the first component is mostly a chimeric transcription factor which can specific bind to the promoter.The second element has a transcription factor binding site for the first element，and thereby controlling the expression of target genes.Here，we review the currentwidely used one component inducible gene expression system，such as the tetracycline inducible expression system，and two components inducible expression systems，including：ethanol-induced，dexamethasone-induced，β2 estrogen hormoneinduced and heat shock-induced systems.This papermainly discusses the recent progress on chemical inducing gene expression systems and their potential use in plants.

chemical induction；activator；effector；single gene cassette；binary gene cassette

10.3969／j.issn.2095-2341.2013.01.09

2012-11-01；接受日期：2012-12-25

馬延娜，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿舆z傳學(xué)。*通訊作者：張曉東，研究員，博士，主要從事作物遺傳育種研究。E-mail：zhangxiaodong＠baafs.net.cn