劉慧敏，鄭文斌，孔令梅，張海都，陳若偉，洪璧楷

（1.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭，515041；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院放射科，廣東 汕頭515041）

急性酒精中毒臨床常見(jiàn)。酒精及其氧化產(chǎn)物，如乙醛、乙酸鹽具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性作用，酒精中毒可以誘導(dǎo)腦組織出現(xiàn)細(xì)胞毒性水腫，早期星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性水腫顯著［1－2］。急性酒精中毒所致腦水腫類(lèi)型及水腫程度在活體水平很難做到定量診斷，而DTI作為MRI的一項(xiàng)新技術(shù)，在診斷腦水腫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）是大腦組織重要的水通道蛋白，在維持大腦組織水平衡中起重要作用，其在各種病理?yè)p害所致的腦水腫形成過(guò)程中的作用機(jī)制越來(lái)越受到關(guān)注。腦干中央的髓鞘溶解即瓦勒變性是酒精中毒腦白質(zhì)嚴(yán)重?fù)p害之一［3－4］。本研究利用DTI參數(shù)值觀察大鼠腦干部在急性酒精中毒后的演變規(guī)律，探討AQP4在腦水腫形成過(guò)程的作用機(jī)制及其與DTI的相關(guān)性，為臨床診斷及治療提供定量影像指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量200～250 g，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。動(dòng)物自由進(jìn)食及飲水。動(dòng)物房?jī)?nèi)12 h光暗交替。相對(duì)濕度55%，溫度22℃。

1.1.2 主要儀器與試劑 使用 GE Signa HDx 1.5 T超導(dǎo)MR儀，3 in線圈，病理攝像彩色頭（日本奧林巴斯公司）及AQP4（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法與步驟

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方案 大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（n＝5）和急性酒精中毒組（n＝25），急性酒精灌酒后1、3、6、12、24 h行 MRI。隨后斷頭取腦，選取腦干部分別行HE染色及AQP4免疫組化染色，比較對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的DTI及病理結(jié)果。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?以往實(shí)驗(yàn)［5］研究表明，當(dāng)以15 ml／kg體質(zhì)量灌胃時(shí)可達(dá)到急性酒精中毒標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)用酒為北京紅星二鍋頭食用白酒（56%v／v），主要成分是乙醇、水，產(chǎn)地北京，按15 ml／kg體質(zhì)量的劑量一次性灌胃。對(duì)照組大鼠以15 ml／kg體質(zhì)量食用自來(lái)水灌胃。

1.2.3 MRI檢查 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 ml／kg體質(zhì)量）麻醉，麻醉滿意后，行 MRI掃描，充分保暖，放置MRI掃描床，俯臥位，頭先進(jìn)。掃描序列包括 T2WI、T1WI及DTI，掃描參數(shù)：T1WI：TR 263.3 ms，TE 23.4 ms，層厚3.0 mm，無(wú)間隔，翻轉(zhuǎn)角90°；T2WI采用FSE：TR 4 420 ms，TE 108.3 ms，層厚3.0 mm，無(wú)間隔，翻轉(zhuǎn)角90°；DTI單次激發(fā)自旋平面回波序列（SE－EPI）：TR 6 000 ms，TE 107.7 ms，層厚3.0 mm，無(wú)間隔，F(xiàn)OV 12 c m×12 cm，矩陣128×128，NEX 1，b值＝1 000 s／mm2，采集方向?yàn)?5個(gè)。

1.2.4 DTI數(shù)據(jù)處理 MRI掃描完成后將原始數(shù)據(jù)送至 A W4.3工作站（GE mdeiacl syste m advantage window 4.3），使用Functool軟件重建ADC圖及部分各向異性（fractional anisotropy，F(xiàn)A）圖，將大小為5 mm2的ROI置于原始圖像腦干部進(jìn)行測(cè)量。為減少測(cè)量時(shí)放置ROI受主觀因素影響，請(qǐng)2位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師測(cè)量，取平均值。

1.2.5 病理學(xué)檢查 取材后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，組織塊經(jīng)脫水透明石蠟包埋成塊，組織切片烤干后分別行HE、AQP4免疫組織化學(xué)染色。免疫組化染色圖像分析應(yīng)用Image－Pro Pl us 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)測(cè)定免疫反應(yīng)產(chǎn)物的累積光密度值（IOD值），每張切片取5個(gè)視野，所得數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算取每組均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值以±s表示。急性酒精中毒各組均數(shù)分別與對(duì)照組進(jìn)行獨(dú)立樣本均數(shù)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MRI檢查結(jié)果 對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠在常規(guī)T2WI及T1WI均未見(jiàn)明顯異常信號(hào)。DTI掃描（圖1，2，見(jiàn)封3），ADC值及FA值測(cè)量結(jié)果（見(jiàn)表1）：實(shí)驗(yàn)組1、3、6 h ADC值與對(duì)照組比較組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），12、24 h組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)FA值與對(duì)照組比較組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。酒精中毒組ADC值與FA值24 h內(nèi)變化趨勢(shì)一致，先持續(xù)降低后逐步回升（圖3，見(jiàn)封3）。

2.2 病理組織學(xué)檢查結(jié)果 HE染色（圖4，見(jiàn)封3）：對(duì)照組腦干部細(xì)胞形態(tài)正常，細(xì)胞間隙未見(jiàn)增寬及變窄，細(xì)胞染色均勻，中毒組星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目減少、核固縮，突起減少或消失，神經(jīng)纖維束疏松；AQP4免疫組化染色（圖5，見(jiàn)封3），對(duì)照組平均光密度值為0.228±0.022，造模后急性酒精中毒組AQP4表達(dá)光密度值先持續(xù)降低后逐步回升（圖3，見(jiàn)封3），3 h達(dá)最低點(diǎn)，1、3、6、12、24 h平均光密度值分別為0.218±0.038，0.201±0.035，0.209±0.027，0.225±0.032，0.229±0.028；與對(duì)照組比較，3、6 h的AQP4表達(dá)光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），1、12、24 h差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 酒精中毒各組ADC、FA值（±s）

表1 酒精中毒各組ADC、FA值（±s）

注：FA：部分各項(xiàng)異性；＊P＜0.01

參數(shù)值 對(duì)照組 急性酒精中毒組1 h 3 h 6 h 12 h 24 h ADC值（×10－3 mm2／s）FA值0.880±0.014 0.341±0.062 0.845±0.052＊0.339±0.023 0.800±0.056＊0.314±0.021 0.837±0.033＊0.319±0.054 0.873±0.062 0.331±0.031 0.879±0.057 0.335±0.023

3 討論

腦水腫主要分2種類(lèi)型，細(xì)胞毒性水腫和血管源性水腫。細(xì)胞毒性水腫指在血腦屏障完整的條件下，水分子主要積聚在細(xì)胞內(nèi)，常繼發(fā)于各種缺血、缺氧性腦損害；血管源性水腫指血腦屏障受損，毛細(xì)血管通透性增加，液體主要積聚在細(xì)胞外周，多見(jiàn)于腦挫裂傷、腦腫瘤壓迫和炎癥性疾病［6］。急性酒精中毒引起的腦水腫類(lèi)型主要是細(xì)胞毒性水腫［1－2］；酒精在代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量的氧自由基，易直接對(duì)腦組織產(chǎn)生氧化損傷［7］；酒精干擾谷氨酸鹽受體、阿片類(lèi)物質(zhì)、GABA（γ－氨基丁酸）受體及5－羥色胺等多種物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外的分布，造成細(xì)胞內(nèi)外滲透梯度改變［8－11］。酒精代謝產(chǎn)物乙醛及乙酸鹽具有較高的神經(jīng)毒性作用，血液中高濃度乙醛可以直接滲透血腦屏障，干擾遞質(zhì)傳遞，直接附著于蛋白、酶、核酸及其他一些生物因子并干擾它們的功能。乙酸鹽堆積抑制葡萄糖代謝，造成ATP生成減少，Na＋／K＋泵功能受限，Na＋在細(xì)胞內(nèi)堆積，引起細(xì)胞腫脹，另外葡萄糖代謝受抑制，局部血流量減少，誘發(fā)腦組織缺血缺氧性損害［12－13］。細(xì)胞內(nèi)外離子分布失衡、缺血缺氧性損害以及滲透梯度變化均可誘發(fā)細(xì)胞毒性水腫。

DTI作為MRI的新技術(shù)，不僅對(duì)評(píng)價(jià)錐體束病變及檢測(cè)彌漫性軸索損傷（DAI）具有一定敏感性［14－15］，而且可以檢測(cè)水分子彌散的FA、彌散速率及彌散方向的改變，定量分析ADC值及FA值的變化。ADC值變化不僅反映細(xì)胞內(nèi)外水自穩(wěn)狀態(tài)，而且可以反映細(xì)胞外間隙及細(xì)胞體積變化，水分子在細(xì)胞內(nèi)彌散運(yùn)動(dòng)受到細(xì)胞膜及細(xì)胞器的限制。當(dāng)細(xì)胞外水分移至細(xì)胞內(nèi)時(shí)，水分子彌散速率較正常組織減小，ADC值較正常組織減低。水分子彌散速率較正常組織增加，ADC值增高是出現(xiàn)血管源性水腫的標(biāo)志［2，16］。FA值代表彌散各向異性，其值正常范圍是0～1，0代表彌散方向最大同向性，1代表彌散方向最大異向性。研究［17］證實(shí)，組織內(nèi)液體徑向彌散速率降低時(shí)，F(xiàn)A值出現(xiàn)降低趨勢(shì)。李雪萊等［2］研究重癥急性酒精中毒大鼠1 h內(nèi)腦組織變化情況發(fā)現(xiàn)，重度酒精中毒組大鼠腦組織在DWI上出現(xiàn)異常高信號(hào)，ADC值降低。本實(shí)驗(yàn)中，酒精中毒后24 h內(nèi)研究結(jié)果表明，ADC值和FA值變化趨勢(shì)表現(xiàn)為先下降后逐步回升，灌酒3 h內(nèi)大鼠腦干部ADC值出現(xiàn)持續(xù)下降，原因在于急性酒精中毒早期以細(xì)胞毒性腦水腫為主，酒精及其代謝產(chǎn)物滲透細(xì)胞膜，引起細(xì)胞內(nèi)代謝發(fā)生紊亂，酶和膜系統(tǒng)發(fā)生功能障礙，鈉鉀泵失調(diào)及大量鈣離子內(nèi)流，使細(xì)胞外水進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)水分子彌散受到細(xì)胞膜及細(xì)胞器的限制，所以ADC值降低，這與李雪萊等［2］研究結(jié)果基本一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明3 h后ADC值是逐步回升的，提示細(xì)胞毒性水腫程度的減輕。FA值出現(xiàn)的變化趨勢(shì)與ADC值一致，是先降低后回升，但各時(shí)間點(diǎn)FA值與對(duì)照組比較，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們認(rèn)為，急性酒精中毒對(duì)腦干組織微結(jié)構(gòu)和環(huán)境改變有一定的影響，但對(duì)反映水分子擴(kuò)散各向異性程度的FA值變化不明顯，間接反映了急性酒精中毒腦干部組織完整性破壞并不嚴(yán)重，提示水腫狀態(tài)恢復(fù)正常是組織結(jié)構(gòu)完整的基礎(chǔ)。

AQP4作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的水通道蛋白，主要在血－腦和腦脊液－腦交界面上的星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)，對(duì)維持腦內(nèi)水平衡起著非常重要的作用。由于研究側(cè)重點(diǎn)、方法及部位的不同，AQP4在腦水腫形成及發(fā)展過(guò)程中的變化仍存在爭(zhēng)議。Amir y－Moghadda m等［18］研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞足突部AQP4能夠調(diào)節(jié)水分子的雙向運(yùn)輸，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)水分子積聚增多時(shí)，AQP4表達(dá)下調(diào)以減少水分子內(nèi)流，細(xì)胞間隙內(nèi)水分子積聚增多即血管間隙內(nèi)水分子積聚增多時(shí)，AQP4表達(dá)上調(diào)轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞外水分子至細(xì)胞內(nèi)。研究證實(shí)［19－21］，在腦組織缺血缺氧早期AQP4表達(dá)是降低的，這反映了機(jī)體內(nèi)在的防御機(jī)制，即AQP4在早期的表達(dá)降低減少了細(xì)胞外水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制了膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性水腫的加重。Ke等［22］對(duì)大鼠重癥腦外傷模型AQP4在腦水腫發(fā)展過(guò)程中表達(dá)多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，腦外傷血腦屏障遭到破壞時(shí)，即血管源性水腫時(shí)，AQP4表達(dá)下調(diào)以防止在滲透梯度及靜水壓的作用下水分子由血液進(jìn)入腦組織，阻止腦水腫進(jìn)一步惡化，在細(xì)胞毒性水腫存在時(shí)預(yù)測(cè)AQP4通道能夠和K＋ 通道協(xié)同作用減輕細(xì)胞腫脹程度。湯崇輝［23］在急性酒精中毒對(duì)大鼠顱腦創(chuàng)傷后腦水腫研究中發(fā)現(xiàn)，急性酒精中毒能夠加重腦水腫程度，AQP4的表達(dá)有利于腦水腫消退。實(shí)驗(yàn)組大鼠腦干部AQP4表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)為先下降后逐步回升，3 h下調(diào)到達(dá)最低點(diǎn)，到24 h AQP4表達(dá)上調(diào)超過(guò)正常對(duì)照組。細(xì)胞外水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，腦組織出現(xiàn)細(xì)胞毒性水腫，由于機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制，AQP4下調(diào)以減少依賴(lài)AQP4通道的水分子從細(xì)胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，以抑制細(xì)胞毒性水腫的加重，3 h后AQP4表達(dá)上調(diào)，由于AQP4雙側(cè)雙向轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和AQP4表達(dá)的實(shí)效性及階段性特點(diǎn)，AQP4不僅是水進(jìn)入腦組織的通路，也是水排出腦組織的主要通路，可易化腦內(nèi)多余水分的清除［24］。

研究表明［25］，正常腦組織中AQP4表達(dá)可以調(diào)節(jié)ADC值，在中風(fēng)及外傷等急性神經(jīng)性疾病中，影像學(xué)改變部分歸因于組織AQP4表達(dá)水平的改變。本實(shí)驗(yàn)中，酒精中毒后3 h內(nèi)細(xì)胞水腫程度逐漸加重，ADC值逐步降低，在同時(shí)間段里，AQP4表達(dá)下調(diào)，這反映了機(jī)體為阻止水分子進(jìn)一步向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、減輕細(xì)胞內(nèi)水腫而出現(xiàn)相應(yīng)的保護(hù)性機(jī)制。酒精中毒3 h后AQP4表達(dá)及ADC值不再繼續(xù)下降，而同期出現(xiàn)逐漸回升，這反映了細(xì)胞內(nèi)水腫程度的逐步減輕、細(xì)胞內(nèi)微環(huán)境逐漸改善。DTI檢查反映了急性酒精中毒早期所出現(xiàn)的細(xì)胞毒性水腫，ADC值變化可以為臨床對(duì)急性酒精中毒的治療提供參考價(jià)值。

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