師　巖,　齊曉丹，　張　偉，　張　帆，　寧小美，　李淑艷，　張春晶△

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 1生物化學(xué)教研室， 4計(jì)算機(jī)教研室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 2內(nèi)分泌科， 3心胸外科，黑龍江 齊齊哈爾 161000)

糖尿病已經(jīng)成為危害人類健康的重要疾病之一，繼發(fā)于糖尿病的糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM) 是部分糖尿病患者發(fā)生心力衰竭和死亡的重要原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此對(duì) DCM 患者的早期干預(yù)治療有著重要的意義。2004年，美國糖尿病學(xué)會(huì)(American Diabetes Association, ADA)年會(huì)提出了糖尿病及其慢性并發(fā)癥都有統(tǒng)一發(fā)病機(jī)制，即高血糖損傷的共同基礎(chǔ)——氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激在 DCM 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，大量氧自由基及活性氧(reactive oxygen species,ROS)直接損傷心肌細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡，最終表現(xiàn)為心肌細(xì)胞功能障礙[1-2]。因此抗氧化治療成為防治糖尿病心肌病的一個(gè)有效途徑。大量研究顯示[3]，肌肽作為一種內(nèi)源性的抗氧化劑,它具有水溶性好、性質(zhì)穩(wěn)定、分子量小、易于被機(jī)體利用等優(yōu)點(diǎn)[4]。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9c2為對(duì)象，建立高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷模型，觀察肌肽拮抗高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及其作用機(jī)制，為肌肽在臨床用于防治糖尿病心肌病并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

材　料　和　方　法

1材料

H9c2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心)；肌肽(Sigma)，胎牛血清(HyClone),0.25%胰酶-0.02%EDTA(吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司),DMEM培養(yǎng)基(Gibco),DCFH-DA(Sigma)?；罨痗aspase-8、caspase-9和caspase-3抗體(Abcam)。流式細(xì)胞儀(Becton)。Bio-Rad Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)。

2方法

2.1心肌細(xì)胞培養(yǎng) H9c2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組及預(yù)處理方式 細(xì)胞分組：(1)正常對(duì)照組(NC組)：葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；(2)高糖損傷組(HG組)：葡萄糖濃度分別為20、25和30 mmol/L;(3)高糖+肌肽預(yù)保護(hù)組(Car+HG組)提前6 h加入濃度20 mmol/L肌肽預(yù)保護(hù)。

2.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞以2×104/well的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，換不含血清的新鮮DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)6 h，使細(xì)胞同步化。分組給藥同上，每組設(shè)6個(gè)平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入50 μL新鮮配制的1 g/L MTT，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，37 ℃輕搖10 min溶解紫色結(jié)晶。30 min內(nèi)置酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)。

2.4DCFH-DA探針檢測(cè)ROSH9c2細(xì)胞用0.25%胰酶-0.02% EDTA消化，以(1.5～2)×108/L接種于60 mm培養(yǎng)板中。常規(guī)培養(yǎng)至75～80%，用不完全DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。細(xì)胞分組同上，每組3個(gè)復(fù)皿。在經(jīng)過處理的細(xì)胞中加入10 μmol/L DCFH-DA，37 ℃、5%CO2孵育20～30 min。細(xì)胞沉淀先用PBS洗2次，再用1 mL PBS液重懸細(xì)胞后收集至1.5 mL離心管中，然后用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定熒光強(qiáng)度，其激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為510 nm。

2.5Westem blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)收集并裂解細(xì)胞，提取蛋白。以等量蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至 NC 膜上，5%脫脂奶粉37 ℃封閉90 min，抗活化caspase-8、caspase-9和caspase-3抗體4 ℃過夜孵育。1∶2 000 HRP-標(biāo)記的抗體室溫下孵育1 h，ECL Plus 檢測(cè)。同時(shí)以GAPDH作內(nèi)參照，采用Bio-Rad Gel-Doc凝膠成像系統(tǒng)對(duì)Western blotting結(jié)果進(jìn)行分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

運(yùn)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間差異采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)　　果

1肌肽對(duì)高糖誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞存活率的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度葡萄糖刺激24 h后，H9c2細(xì)胞的存活率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。20、25和30 mmol/L葡萄糖處理48 h和72 h后，與24 h相比細(xì)胞存活率降低，隨著高糖刺激時(shí)間和高糖濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1，提示細(xì)胞存活率具有時(shí)間、濃度依賴性。30 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，細(xì)胞存活率小于40%，25 mmol/L葡萄糖刺激48 h后，細(xì)胞存活率約50%，提示25 mmol/L濃度能兼顧體現(xiàn)高糖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷和適當(dāng)?shù)募?xì)胞死亡率，因此本實(shí)驗(yàn)選擇25 mmol/L為常規(guī)高糖刺激組。高糖刺激72 h細(xì)胞死亡率過高，選擇高糖刺激48 h，既可造成心肌細(xì)胞可逆性氧化應(yīng)激損傷，又能較好反應(yīng)抗氧化劑肌肽對(duì)心肌的保護(hù)作用。25 mmol/L葡萄糖刺激48 h并加入肌肽預(yù)保護(hù)的細(xì)胞中，細(xì)胞的存活率較其它高糖組顯著提高，可由高糖損傷組的57.74%±2.43%增加到82.62%±2.61%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Figure 1. Effects of different concentrations of high glucose on the survival rate of H9c2 cells detected by MTT assay.Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal control (NC) group.

圖1MTT檢測(cè)不同濃度高糖對(duì)H9c2細(xì)胞存活率的影響

2肌肽清除細(xì)胞內(nèi)自由基的作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果見圖2，25 mmol/L高糖刺激H9c2細(xì)胞48 h后細(xì)胞DCFH-DA的平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity, MFI)(紅色熒光)與正常對(duì)照組細(xì)胞(藍(lán)色熒光)相比,熒光強(qiáng)度增加42.0%±3.2%，表示ROS水平明顯增高(P<0.05)，而給予20 mmol/L肌肽后，熒光強(qiáng)度(綠色熒光)與高糖組細(xì)胞相比降低了35.0%±2.7%(P<0.05)，且與正常細(xì)胞相近，說明肌肽可明顯抑制高糖引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Figure 2. Flow cytometry analysis of DCFH-DA fluorescence intensity. Normal control (NC) group:blue fluorescence; high glucose (HG, 25 mmol/L) group:red fluorescence; carnosine(Car, 20 mmol/L)+HG group:green fluorescence. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsHG group.

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞48h后細(xì)胞內(nèi)DCFH-DA熒光強(qiáng)度

3Westernblotting分析肌肽對(duì)細(xì)胞caspase家族蛋白表達(dá)影響

Western blotting檢測(cè)結(jié)果及灰度掃描后的目的條帶與GAPDH比值見圖3。高糖組與正常對(duì)照組相比, caspase-3相對(duì)含量(6.41±0.65vs2.21±0.53)、caspase-8相對(duì)含量(7.32±0.91vs1.15±0.49)和caspase-9相對(duì)含量(4.07±0.54vs0.51±0.31)均明顯增多(P<0.05)。肌肽預(yù)保護(hù)組與高糖組相比，caspase-3相對(duì)含量(4.71±0.59vs6.41±0.65)和caspase-9相對(duì)含量(2.95±0.41vs4.07±0.54)均顯著降低(P<0.05)，但caspase-8相對(duì)含量(7.64±0.89vs7.32±0.91)較高糖組無顯著改變(P>0.05)。以上數(shù)據(jù)表明，高糖可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，而肌肽可通過下調(diào)caspase-9和 caspase-3蛋白表達(dá)水平而抑制凋亡。

Figure 3. Protein expression of activated caspase-3, -8 and -9 in H9c2 cells detected by Western blotting. A:normal control(NC) group; B:high glucose(HG,25 mmol/L) group; C: carnosine(Car,20 mmol/L)+HG group. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsHG group.

圖3Westernblotting法檢測(cè)活化caspase-3、-8和-9蛋白的表達(dá)

討　　論

1972 年，Rubler 等發(fā)現(xiàn)糖尿病患者患有的特異性心肌病變，后被定義為DCM。該疾病包括了微血管病變和心肌細(xì)胞代謝紊亂引起的心臟病變。DCM是心肌對(duì)糖尿病的急性反應(yīng)而導(dǎo)致的慢性病理改變，這些急性反應(yīng)包括基因表達(dá)異常、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變及細(xì)胞凋亡[5]。H9c2細(xì)胞源于胚胎期大鼠心臟，保持很多心肌細(xì)胞的特征，可用于高糖的體外研究。我們以MTT法檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞在不同高糖濃度、不同時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞存活率，建立高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型組。研究證明，糖尿病心肌病的重要發(fā)病機(jī)制之一是高血糖損傷心肌細(xì)胞引起ROS生成增多[6]。Fiordalis等[7]在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠心臟標(biāo)本中也發(fā)現(xiàn)，DCM增加心肌細(xì)胞凋亡的同時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)ROS增加了2倍以上，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激加強(qiáng)。ROS所致的氧化應(yīng)激是造成細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)。我們通過DCFH-DA探針檢測(cè)ROS，證明了高糖誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。近年來Mohammad等[8]證明了抗氧化劑在預(yù)防ROS引起的心肌細(xì)胞損傷方面可以發(fā)揮有益作用。肌肽作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，具有多種抗氧化作用，可以有效清除活性氧和自由基，對(duì)于改善與治療2型糖尿病并發(fā)癥有很好應(yīng)用前景[9]，在防治糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病、糖尿病心血管病及糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)損害等方面已有報(bào)道[10]。我們?cè)l(fā)現(xiàn)：一定濃度的肌肽能有效抑制高糖誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，氧化應(yīng)激在糖尿病血管病變中的損傷作用已得到證實(shí)[11]。為了進(jìn)一步證明肌肽這種抗氧化劑在糖尿病心血管疾病中的作用，本實(shí)驗(yàn)以H9c2細(xì)胞為對(duì)象，建立高糖損傷模型，研究肌肽抑制高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷作用及機(jī)制。糖尿病心肌病大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其發(fā)生主要由2條信號(hào)通路介導(dǎo)，即外在途徑和內(nèi)在途徑[12]。外在途徑是死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)通路，即胞外凋亡信號(hào)與膜上的凋亡受體相結(jié)合使caspase-8激活, 活化的caspase-8又激活caspase-3, 誘導(dǎo)凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]；內(nèi)在途徑是線粒體介導(dǎo)的信號(hào)通路，即各種損傷因素通過促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C等信號(hào)分子，然后激活caspase-9和caspase-3而介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[14]。Caspase蛋白酶家族引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，剪切底物使凋亡得以進(jìn)行，在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起著中心作用。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)至少13種caspase家族成員參與了細(xì)胞凋亡，但在心肌細(xì)胞凋亡中以caspasc-3、-8和-9的作用最為重要。為了研究肌肽抑制高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的作用，我們利用Western blotting方法重點(diǎn)檢測(cè)了caspase家族蛋白中caspase-3、-8和-9的表達(dá)量。高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞48 h后，高糖組中caspase-3、-8和-9均高表達(dá)。Bojunga[15]等人的研究同樣認(rèn)為，高血糖增加心肌細(xì)胞凋亡的過程中，增加了心肌Fas受體和caspase-8的表達(dá)，說明高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡可以通過外在途徑和內(nèi)在途徑2條信號(hào)通路。而肌肽預(yù)保護(hù)組的caspase-9和caspase-3表達(dá)量降低，caspase-8表達(dá)量沒有明顯變化,因此推測(cè)肌肽作用于高糖環(huán)境下的心肌細(xì)胞，可以通過線粒體信號(hào)通路介導(dǎo)抗氧化作用，抑制caspase-9和caspase-3表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞免受高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和凋亡損傷，而與外在途徑死亡受體介導(dǎo)的信號(hào)通路關(guān)系不大。

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