肖　銳，　陳榮昌

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科，廣東 廣州 511400； 2呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州市呼吸疾病研究所，廣東 廣州 510320)

目前，機(jī)械通氣支持治療在重癥監(jiān)護(hù)病房中得到普遍應(yīng)用，特別是在救治急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合癥的病人發(fā)揮了重要作用。盡管機(jī)械通氣有挽救生命的作用，它也能導(dǎo)致健康肺或有基礎(chǔ)疾病肺的嚴(yán)重?fù)p傷。天然免疫和炎癥反應(yīng)在“生物傷”中的重要作用日益受到重視，它們之間形成的復(fù)雜的免疫炎癥調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子也是研究者們選擇作為呼吸機(jī)所致肺損傷生物標(biāo)志物的優(yōu)先候選分子。

研究發(fā)現(xiàn)機(jī)械通氣過程中的物理牽拉和剪切應(yīng)力能誘導(dǎo)炎癥細(xì)胞募集和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生。中性粒細(xì)胞和其介質(zhì)參與了呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury, VILI)的形成[1]。白細(xì)胞的激活和吸引是發(fā)生“生物傷”的重要特征。動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞缺乏的動物VILI發(fā)生的可能性顯著降低。中性粒細(xì)胞在持續(xù)性肺損傷的正反饋環(huán)中處于一個中心地位[2]。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)是一種陽性急性期蛋白。NGAL作為一種分泌蛋白，主要在粒細(xì)胞前體細(xì)胞和各種上皮細(xì)胞中表達(dá)[3]。肺泡上皮細(xì)胞在炎癥反應(yīng)中既是效應(yīng)細(xì)胞又是靶細(xì)胞，在VILI的病理生理演變過程中具有重要作用[4]。因此，我們設(shè)想NGAL可能作為機(jī)械力和炎癥刺激的感受器參與了VILI的發(fā)病機(jī)制。由于NGAL具有廣泛參與炎癥和免疫反應(yīng)的生物學(xué)特性；并且是一種急性期反應(yīng)的分泌蛋白，易于在血清和肺泡灌洗液中檢測到；并且是與中性粒細(xì)胞密切相關(guān)的重要分子，鑒于這些特性，NGAL是作為VILI生物標(biāo)志物的最佳候選靶標(biāo)。我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖怯^察小鼠VILI模型中不同機(jī)械通氣策略對NGAL表達(dá)的影響，希望能為早期診斷VILI找到新的生物標(biāo)志物。

材　料　和　方　法

1材料

Trizol試劑購自Invitrogen。 AffinityScript qPCR cDNA 合成試劑盒和2×BrilliantⅡSYBR Green qPCR Master 試劑盒購自Stratagene。RIPA裂解液和BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量試劑盒購自Pierce?？剐∈螃?actin單克隆抗體購自Santa Cruz。大鼠抗小鼠NGAL單克隆抗體購自R&D Systems；兔抗大鼠IgG-H&L(HRP)抗體購自 Abcam；發(fā)光底物試劑盒(SuperSignal? West Pico Chemiluminescent Substrate)購自Pierce。免疫組化染色試劑盒購自Zymed。

2.1小鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷動物模型的建立雄性C57BL/6小鼠，共30只，6至8周齡，體重21.0～28.4 g。小鼠用戊巴比妥鈉(65 mg/kg)麻醉。氣管切開，插入氣管導(dǎo)管， 動物取仰臥位置于Buxco動物生理信號采集系統(tǒng)的動物倉內(nèi)，連接容量控制型小動物呼吸機(jī)(Harvard, Model 683)或壓力控制型小動物呼吸機(jī)(Harvard, Model BS4 55-7059 Inspira)。氣道壓力和通氣流量用Buxco動物生理信號采集系統(tǒng)監(jiān)測。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為5組：(1)對照組: 小鼠氣管切開插管后自主呼吸2 h,n=6。(2)高吸氣末峰壓(high peak inflation pressure，H-PIP;n=6)組：小鼠連接呼吸機(jī)后，給予50 cmH2O PIP和2.5 cmH2O 呼氣末正壓(positive end-expiratory pressure，PEEP)，呼吸頻率17 breaths/min、潮氣量約1 mL，通氣2 h。實(shí)驗(yàn)過程中適當(dāng)調(diào)整潮氣量以維持PIP在50 cmH2O。(3)低吸氣末峰壓(low peak inflation pressure，L-PIP;n=6)組：小鼠連接呼吸機(jī)后，給予15 cmH2O PIP，0 cmH2O PEEP，呼吸頻率120 breaths/min, 潮氣量約0.29 mL，通氣2 h。(4)大潮氣量(high volume，HV)組：小鼠連接呼吸機(jī)后，給予30 mL/kg、0 cmH2O PEEP，呼吸頻率65 breaths/min,通氣2 h。(5)小潮氣量(low volume，LV)組：小鼠連接呼吸機(jī)后，給予6 mL/kg、5 cmH2O PEEP，呼吸頻率135 breaths/min,通氣2 h。

2.2實(shí)驗(yàn)動物標(biāo)本的收集機(jī)械通氣結(jié)束后腹腔注入戊巴比妥鈉處死動物。(1)小鼠血清的收集：摘取小鼠眼球取外周血約0.6 mL，4 ℃放置過夜后5 000 r/min離心30 min，取上清，每管100 μL分裝，-70 ℃保存。進(jìn)行Western blotting檢測。(2)小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的收集:收集完小鼠血清后，0.6 mL冰PBS液由注射器從氣管套管注入小鼠肺，反復(fù)抽吸3次，回收率約90%。4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取上清，每管100 μL分裝，-70 ℃保存。進(jìn)行總蛋白測定及Western blotting檢測。(3)小鼠肺右葉取出后迅速放入液氮，次日放置-70 ℃保存。進(jìn)行總蛋白提取，Western blotting檢測。小鼠肺左下葉取出后迅速放入液氮，次日放置-70 ℃保存。進(jìn)行總RNA提取，real-time RT-PCR檢測。

2.3小鼠VILI模型復(fù)制的鑒定機(jī)械通氣(或自主呼吸)2 h 處死動物后，用1 mL冰4%多聚甲醛由注射器從氣管插管注入小鼠肺，用繩扎緊氣道。將整個肺取出放入冰4%多聚甲醛固定24 h后，做石蠟包埋，病理切片、貼片、脫蠟、脫水、HE染色、固定后封片行病理鏡檢。另外，用BCA法測定BALF中總蛋白濃度，按照試劑盒說明書配制工作液和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加25 μL樣品和稀釋標(biāo)準(zhǔn)品到96孔酶標(biāo)板的樣品孔中。再在各孔加入200 μL BCA工作液，搖動混勻30 s。封板，37 ℃放置30 min。冷卻到室溫，用酶標(biāo)儀測定562 nm 的吸光度(A562)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。

2.4小鼠VILI模型肺組織 NGAL mRNA 的表達(dá)利用 Primer 5.0引物設(shè)計軟件設(shè)計擴(kuò)增NGAL基因片段所需的上、下游引物，以β-actin作為內(nèi)參照。引物序列由大連寶生物公司合成。稀釋至10 μmol/L, -20 ℃保存。引物序列(5’-3’)及擴(kuò)增的片段長度如下：NGAL上游引物CCCTGAACTGAAGGAACG,下游引物TTGGTATGGTGGCTGGTG，產(chǎn)物大小231 bp；β-actin上游引物CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC,下游引物ATGGAGCCACCGATCCACA，產(chǎn)物大小171 bp。Real-time RT-PCR的反應(yīng)條件和反應(yīng)體系如下：第1鏈cDNA的合成是按照AffinityScript qPCR cDNA 合成試劑盒說明書配制20 μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，反應(yīng)條件為25 ℃ 5 min；42 ℃ 15 min；95 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA溶液用RNase-free dH2O稀釋到100 μL, -20 ℃保存。以上述cDNA溶液為模板按照BrilliantⅡSYBR Green qPCR Master 試劑盒說明書配制 real-time PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min, 95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s，后兩步重復(fù)40個循環(huán)。所有的樣本都做復(fù)孔。每次檢測都包含有5個已知基因組DNA濃度的等比(10×)稀釋梯度和未加 cDNA 模板的陰性對照獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次檢測包含有溶解曲線的分析。目的基因的表達(dá)量利用相對定量分析法，即ΔΔCt法：ΔCt樣本=Ct目的基因-Ct看家基因，ΔΔCt=ΔCt未知樣本-ΔCt對照樣本，相對表達(dá)水平=2-ΔΔCt。

2.5Western blotting法檢測NGAL 在肺組織、血清和BALF中的表達(dá)用BCA法檢測肺組織總蛋白提取液濃度，并將每個樣本濃度調(diào)整為1 g/L，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜后加入1∶100稀釋的Ⅰ抗(大鼠抗小鼠NGAL單克隆抗體)搖床孵育，4 ℃過夜。洗膜之后用1∶1 000稀釋的酶標(biāo)Ⅱ抗兔抗大鼠IgG-H&L(HRP)室溫下于搖床孵育1 h，反復(fù)洗膜4次，按發(fā)光底物試劑盒說明將A和B 2種試劑在保鮮膜上等體積混合；1 min后，將膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；1 min后，將膜移至另一保鮮膜上，去盡殘液，放入Kodak Image Station 2000R凝膠成像系統(tǒng)中顯影。用凝膠成像系統(tǒng)分析軟件分析條帶灰度值，每個樣本均測3次。計算公式如下：目的蛋白的相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/同一樣本β-actin蛋白的灰度值。

2.6免疫組織化學(xué)法檢測NGAL蛋白的表達(dá)部位將石蠟包埋的小鼠肺組織進(jìn)行脫蠟和水化、洗片后抗原修復(fù)，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，甩去多余液體。滴加Ⅰ抗稀釋液50 μL, 4 ℃過夜。次日組織玻片在37 ℃復(fù)溫45 min，洗片。 滴加Ⅱ抗50 μL， 室溫靜置1 h。洗片3次后 DAB顯色10 min，自來水沖洗10 min。 蘇木精復(fù)染2 min，鹽酸乙醇分化。自來水沖洗10 min后脫水、透明、封片、鏡檢。

3統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析和Tukey-Kramer多重比較檢驗(yàn)法判斷組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

pH值，剩余葡萄糖含量和總蛋白質(zhì)含量具有一定影響?？Х葔A的添加能在一定程度上刺激冠突散囊菌的生長，但在發(fā)酵過程中，其含量并未出現(xiàn)明顯變化，這說明在該發(fā)酵系統(tǒng)中，冠突散囊菌既不能將其作為碳源、氮源分解代謝來維持生長，也不能利用共培養(yǎng)發(fā)酵體系中其他成分來合成咖啡堿。該結(jié)果與前人研究基本一致，且研究表明微生物體系中，利用真菌分解代謝咖啡因遠(yuǎn)比細(xì)菌要難的多[18]，而且只發(fā)生在極少數(shù)的青霉屬和曲霉屬類群中，逐級代謝為茶堿和3-甲基黃嘌呤[19]。

結(jié)　　果

1小鼠VILI模型的復(fù)制

首先，觀察不同通氣策略小鼠肺組織病理改變，評價動物模型復(fù)制情況。從肺組織肉眼觀察發(fā)現(xiàn)，在HV組和H-PIP組小鼠肺組織可見充血水腫，有5例小鼠肺組織表面可見暗紅色斑片狀病灶。鏡下觀察顯示正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常(圖1A);LV組和L-PIP組也未見明顯形態(tài)學(xué)異常(圖1B、C);在HV組和H-PIP組，可見肺泡間隔增厚并有中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)紅細(xì)胞滲出，還有嗜伊紅染色的水腫液和纖維素(圖1D、E)。另外，用BCA法測定BALF中總蛋白的量(表1)。在損傷性肺通氣組，如H-PIP組和HV組BALF中的總蛋白量比正常對照組分別升高了約4.03和2.09倍。結(jié)合病理改變及肺泡腔中蛋白滲出、總蛋白量明顯增加等指標(biāo),可認(rèn)為該模型是成功的。

Figure 1. Pathological changes of mouse lung tissues after exposure to different strategies of mechanical ventilation (HE staining,×400).A: control group; B: LV group; C: L-PIP group; D: HV group; E: H-PIP gourp.

圖1不同通氣策略下小鼠肺組織的病理改變

2不同通氣模式對NGALmRNA表達(dá)的影響

正常肺組織有少量NGAL mRNA的表達(dá)。LV組通氣2 h后，NGAL mRNA的表達(dá)比對照組升高了3.63倍(P<0.01)。 HV組NGAL mRNA的表達(dá)也較對照組升高了3.29倍(P<0.01)，但是HV組與LV組相比，NGAL mRNA的表達(dá)沒有顯著差異(P>0.05)。在壓力控制型機(jī)械通氣中，NGAL mRNA的表達(dá)比正常組仍是增加的，分別為對照組的2.10和41.9倍(P<0.01)，在H-PIP組NGAL mRNA的表達(dá)水平最高，提示損傷性機(jī)械通氣策略能使NGAL mRNA的表達(dá)顯著增加，見圖2。

表1急性肺損傷小鼠BALF中總蛋白含量

Table 1. Total protein in BALF in mouse model of ALI(mg/L.Mean±SD.n=6)

GroupTotalproteininBALFControl621．12±8．67LV1137．50±3．12HV1304．33±4．89L?PIP1266．67±2．78H?PIP2500．00±4．09?

*P<0.05vscontrol.

Figure 2. Expression of NGAL mRNA in mouse lung tissues after exposure to different strategies of mechanical ventilation detected by real-time RT-PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;△△P<0.01vsHV group.

圖2實(shí)時定量RT-PCR測定不同通氣策略下小鼠肺組織NGALmRNA的表達(dá)

3不同通氣模式對NGAL蛋白表達(dá)的影響

NGAL的蛋白表達(dá)變化與其mRNA的變化趨勢基本一致。在BALF中H-PIP組NGAL的蛋白表達(dá)量較其它組明顯增高，約是正常對照組的4倍、HV組的2倍(均P<0.01)；而且其在BALF內(nèi)的量明顯高于在血清和肺組織的表達(dá)量。在LV組和L-PIP組，NGAL蛋白表達(dá)稍微升高，在肺組織、BALF和血清中的表達(dá)水平無明顯差異(P>0.05)，見圖3。

4NGAL蛋白在VILI小鼠動物模型中的作用部位

NGAL主要表達(dá)在肺組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤的中性粒細(xì)胞中，見圖4B、C，還有少量表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞。這提示血管的內(nèi)皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞也參與了VILI的形成。

Figure 3. Expression of NGAL protein in lung tissues, BALF and serum of mice after exposure to different strategy of mechanical ventilation detected by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsHV group.

圖3免疫印跡檢測不同通氣策略下小鼠肺組織、BALF及血清NGAL蛋白的表達(dá)

Figure 4. Location of NGAL expression in mouse lung tissues in the injurious mechanic ventilation model detected by immunohistochemistry. A:negative control; B and C: the intense expression of NGAL in vascular endothelial cells and infiltrating neutrophil (arrow) after injurious mechanic ventilation.

圖4免疫組織化學(xué)法檢測在損傷性通氣肺組織中NGAL的空間定位

討　　論

如今實(shí)驗(yàn)研究中的大多數(shù)鑒別的生物標(biāo)志物主要來源于血漿、血清、肺水腫液、BALF和呼氣冷凝液(exhaled breath condensate，EBC)。這些生物標(biāo)志物可分為細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等；肺上皮細(xì)胞的特異蛋白，如表面活性蛋白A、B、D(surfactant protein A、B、D，SP-A、SP-B、SP-D)；內(nèi)皮細(xì)胞激活的標(biāo)記物，如黏附分子E-選擇素、L-選擇素等[5-6]。有臨床研究中發(fā)現(xiàn)SP-D在保護(hù)性通氣策略是明顯升高，而TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8卻明顯降低。TNF-α、IL-1β和IL-8具有促炎效應(yīng)，而IL-10、sTNFR1和sTNFR2具有抗炎的功能，IL-6和NO在不同的時空條件下具有抗炎或促炎的雙重效應(yīng)，并具有潛在的免疫調(diào)節(jié)功能。但無論是動物或是體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還是臨床實(shí)驗(yàn)都發(fā)現(xiàn)這些蛋白的表達(dá)水平及其變化和潮氣量或呼氣末正壓有一定的相關(guān)性。因此，合理選擇通氣模式及參數(shù)調(diào)整是減少VILI的關(guān)鍵之一。目前臨床常用定容型和定壓型的2種通氣策略。小潮氣量(≤10 mL/kg)通氣是定容型通氣設(shè)置潮氣量的原則。壓力控制型通氣模式中一般認(rèn)為平臺壓≤ 30 cmH2O可有效避免呼吸機(jī)相關(guān)的肺損傷，故設(shè)置的壓力通常在10～20 cmH2O，一般不超過30 cmH2O。我們的實(shí)驗(yàn)選擇了臨床上最常見的2種通氣模式觀察到NGAL在損傷性通氣策略組升高顯著，高吸氣末峰壓組和大潮氣量通氣組NGAL mRNA和蛋白的表達(dá)明顯升高，提示NGAL是對機(jī)械刺激敏感的傳感蛋白，它可能參與了VALI的發(fā)病機(jī)制。

有關(guān)NGAL在VILI中的表達(dá)情況文獻(xiàn)報道較少。Yan等[7]對大鼠頸動脈損傷的動物模型研究中，分離血管平滑肌細(xì)胞并給予血管成形支架，機(jī)械刺激誘導(dǎo)急性期炎癥反應(yīng)的NGAL表達(dá)明顯增高，提示機(jī)械刺激也能誘導(dǎo)NGAL的表達(dá)。Friedl等[8]研究正常生長條件和給予促炎因子刺激后NGAL在上皮細(xì)胞中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NGAL在支氣管杯狀細(xì)胞和肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞表達(dá)，而且在炎癥肺的支氣管和肺泡上皮細(xì)胞表達(dá)增加。盡管NGAL在肺組織有表達(dá)，但是其與VILI相關(guān)的分子病理生理機(jī)制還不清楚。我們實(shí)驗(yàn)中NGAL在VILI小鼠模型中的顯著表達(dá)提示NGAL可能是ALI發(fā)病機(jī)制中炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。免疫組化的結(jié)果顯示NGAL表達(dá)位置在肺的上皮細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞和浸潤的中性粒細(xì)胞。這些結(jié)果強(qiáng)力支持NGAL在急性肺損傷(acute lung injury，ALI)炎癥過程中的重要性。這些結(jié)果也和近來報道的膿毒血癥時血循環(huán)中NGAL的濃度顯著升高，NGAL能抑制中心粒細(xì)胞凋亡的報道一致。

綜上所述，我們利用VILI小鼠動物模型發(fā)現(xiàn)NGAL可以作為判斷VILI新的潛在的生物標(biāo)記物。在臨床工作中檢測血清或BALF中NGAL的水平，可能會為識別VILI高危病人提供依據(jù)。但是，NGAL在VILI發(fā)生機(jī)制中的作用還需要基因沉默或抗體阻斷等體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加以論證。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Tremblay L, Valenza F, Ribeiro SP, et al. Injurious ventilatory strategies increase cytokines and c-fos m-RNA expression in an isolated rat lung model [J]. J Clin Invest, 1997, 99(5): 944-952.

[2]Martin TR, Pistorese BP, Chi EY, et al. Effects of leukotriene B4 in the human lung. Recruitment of neutrophils into the alveolar spaces without a change in protein permeability[J]. J Clin Invest,1989, 84(5):1609-1619.

[3]劉靜，李紹梅，薛雯，等.原發(fā)性腎病綜合征并發(fā)急性腎損傷患者血清及腎組織中NGAL的表達(dá)及意義[J].中國病理生理雜志,2012,28(11):1982-1985.

[4]Schmidt-Ott KM, Mori K, Kalandadze A, et al. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin-mediated iron traffic in kidney epithelia[J]. Curr Opin Nephrol Hypertens,2006, 15(3): 442-449.

[5]Parsons PE, Eisner MD, Thompson BT, et al. Lower tidal volume ventilation and plasma cytokine markers of inflammation in patients with acute lung injury[J]. Crit Care Med,2005, 33(1):1-6.

[6]Ye SQ, Simon BA, Maloney JP, et al. Pre-B-cell colony enhancing factor as a potential novel biomarker in acute lung injury[J]. Am J Respir Crit Care Med,2005, 171(4): 361-370.

[7]Yan ZQ, Sirsjo A, Bochaton-Piallat ML, et al. Augmented expression of inducible NO synthase in vascular smooth muscle cells during aging is associated with enhanced NF-κB activation[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,1999, 19(12):2854-2862.

[8]Friedl A, Stoesz SP, Buckley P, et al. Neutrophil gelatinase- associated lipocalin in normal and neoplastic human tissues: cell type-specific pattern of expression[J]. Histochem,1999,31(7): 433-441.