石成鋼,　胡愛玲,　曾曉琳,　尹瓊麗,　李　梅,　程桂鳳

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 廣州 510630)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性分布，我國為HBV感染大國，HBV導(dǎo)致的腎炎在繼發(fā)性腎炎中占據(jù)相當(dāng)大的比例，但是對于乙型肝炎病毒相關(guān)性腎小球腎炎(hepatitis B virus-associated glomerulonephritis，HBV-GN)的診斷及發(fā)病機制還存在著很多爭議，目前國內(nèi)外關(guān)于HBV-GN還沒有統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)。1989年“北京乙型肝炎病毒相關(guān)腎炎座談會”制定了我國首個HBV-GN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]：(1)血清HBV抗原陽性；(2)患腎小球腎炎，并可除外狼瘡腎炎等繼發(fā)性腎小球疾?。?3)腎組織中找到HBV抗原。其中，第3點為必備條件。2000年全國腎活檢病理診斷研討會[2]提出HBV-GN的免疫病理表現(xiàn)為腎小球內(nèi)有HBsAg、HBcAg或HBeAg沉積。但此診斷標(biāo)準(zhǔn)存在2個主要問題：(1)腎組織切片中雖然找到HBV或其抗原，但HBV或其抗原并未致病，而是合并其它腎小球腎炎；亦可能由于含HBV的血液污染腎組織標(biāo)本所致假陽性而致誤診；(2)確系HBV-GN，但由于HBV激活腎臟損傷后，腎活檢時腎組織中已無HBV或其抗原或者是對HBV及其抗原進(jìn)行染色時出現(xiàn)假陰性而導(dǎo)致漏診[3]。

對乙型肝炎的研究提示HBV是通過前S區(qū)(preS)與肝細(xì)胞膜位點結(jié)合進(jìn)入肝臟致病的， 前S1(preS1)是病毒復(fù)制指標(biāo)，前S1/S2抗原(preS1/S2 antigen,preS1/S2-Ag)具有強免疫原性。那么，preS1區(qū)可能介導(dǎo)HBV進(jìn)入腎組織細(xì)胞，也可通過自身較強的免疫原性產(chǎn)生免疫反應(yīng)，在HBV-GN致病機制中發(fā)揮作用。對該機制的深入研究及證實，須首先明確在合并有HBV感染的患者腎組織中有無preS的表達(dá)。因此，本研究旨在通過免疫組織化學(xué)方法檢測HBV-GN患者腎組織中preS1/S2(1～176 aa)抗原的表達(dá)，探討腎組織preS抗原及其它HBV抗原檢測在HBV-GN診斷中的應(yīng)用價值。

材　料　和　方　法

1材料

1.1病例選擇回顧性研究2003年1月至2013年1月于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院住院治療并送檢腎臟病理檢查的患者。病例組49例患者，男性37例，女性12例，年齡16～55歲，入組病例病理類型：膜性腎病(membranous nephropathy，MN)17例，膜增生性腎小球腎炎(membranoproliferative glomerulonephritis,MPGN)6例，IgA腎病 (IgA nephropathy，IgAN)13例，系膜增生性腎小球腎炎(mesangioproliferative glomerulonephritis，MsPGN)3例，增生硬化性腎小球腎炎(proliferativesclerosing glomerulonephritis，SPGN)8例，腎小球輕微病變(glomerular minimal-change di-sease，MCD)2例。

1.1.1病例組(1)血清學(xué)HBsAg(+)，HBsAb(-)；(2)有血尿、蛋白尿等臨床表現(xiàn)；(3)經(jīng)腎組織活檢病理明確診斷為腎小球腎炎。

1.1.2對照組1(非腎小球腎炎組)腎癌3例，腎結(jié)石2例：(1)血清學(xué)HBsAg(+)，HBsAb(-)；(2)病理診斷為腎結(jié)石或腎癌等非腎小球腎炎疾病。

1.1.3對照組2(非乙肝組)5例：(1)血清學(xué)HBsAg(-)；(2)腎組織活檢病理診斷為腎小球MCD。

剔除標(biāo)準(zhǔn)：(1)系統(tǒng)性紅斑狼瘡；(2)過敏性紫癜；(3)糖尿??；(4)血清學(xué)HCV-IgG(丙型肝炎病毒IgG抗體)陽性。合并有以上可導(dǎo)致繼發(fā)性腎小球疾病病因的患者均予剔除。

1.2主要試劑和儀器兔抗人PreS1/S2-Ag多克隆抗體購自R&D，鼠抗人HBeAg單克隆抗體購自Fitzgerald，鼠抗人HBsAg和HBcAg單克隆抗體工作液購自Novocastra，EnVision試劑盒購自DAKO，NovoLink試劑盒購自Novocastra，HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb和HBcAb血清學(xué)檢測試劑購自深圳華康生物工程有限公司，血清HBV-DNA檢測購自廣州市達(dá)安基因公司的試劑，抗HCV-IgG購自中山生物工程有限公司；組織切片圖像采集系統(tǒng)由Nikon Eclipse 80i正置顯微鏡、數(shù)碼相機用控制器Nikon digital sight DS-U2和顯微攝像圖像處理軟件NIS Elements BR 2.30(Nikon)采集組織切片圖像構(gòu)成。

2方法

2.1臨床檢驗患者尿常規(guī)、血清肌酐、24 h尿蛋白定量及血清免疫學(xué)指標(biāo)為入院后常規(guī)送檢，抗原抗體檢測均采用ELISA，由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗科完成。采用real-time PCR檢測血清HBV-DNA，檢測下限1×106copies/L，由中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院感染科實驗室完成。

2.2腎組織內(nèi)preS1/S2-Ag和HBcAg的檢測采用免疫組化方法：石蠟切片貼于硅化玻片上，置55 ℃烤箱1 h，而后置恒溫箱過夜；二甲苯(微波爐低火檔)脫蠟5 min×3次；經(jīng)無水乙醇脫水5 min、再經(jīng)95%乙醇、80%乙醇脫水各3 min；蒸餾水沖洗5 min 2次， 3%雙氧水微波爐低火檔處理3 min消除內(nèi)源性生物素；蒸餾水沖洗5 min 2次，在電磁爐上加熱EDTA溶液(pH 8.0)至沸騰后將組織芯片放入，蓋上鍋蓋，待上氣后2 min，停止加熱，迅速冷卻；PBS沖洗3次，每次5 min，甩去載玻片上多余液體，用DAKO筆在載玻片上圈住所需染色蠟片，圈內(nèi)滴加胃酶孵育15 min；PBS沖洗3次，每次5 min，以除去完成消化的胃酶，滴加Ⅰ抗(兔抗人preS1/S2-Ag多克隆抗體稀釋度為1∶80；HBcAg工作液)，陰性對照采用PBS代替Ⅰ抗，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min；PBS沖洗3次，每次5 min，以除去未結(jié)合的Ⅰ抗，滴加Novocastra封閉劑，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min，以除去未結(jié)合的Ⅰ抗，滴加NovoLink聚合物，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色3 min，置顯微鏡下觀察，控制顯色程度，清水沖洗中止反應(yīng)10 min；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，清水沖洗返藍(lán)10～20 min；95%乙醇水化1 min，置于55 ℃烤箱1 h；二甲苯透明5 min，中性樹脂封固。

2.3腎組織內(nèi)HBeAg和HBsAg的檢測采用EnVision免疫組化法：蠟切片貼于硅化玻片上，置55 ℃烤箱1 h后恒溫箱過夜； 二甲苯(微波爐低火檔)脫蠟5 min×3次；經(jīng)無水乙醇脫水5 min、再經(jīng)95%乙醇、80%酒精脫水各3 min；蒸餾水沖洗5 min 2次， 3%雙氧水微波爐低火檔處理3 min消除內(nèi)源性生物素；蒸餾水沖洗5 min 2次，在電磁爐上加熱EDTA溶液(pH 8.0)至沸騰后將組織芯片放入，蓋上鍋蓋，待上氣后2 min，停止加熱，迅速冷卻；PBS沖洗3次，每次5 min，甩去載玻片上多余液體，用DAKO筆在載玻片上圈住所需染色蠟片，圈內(nèi)分別滴加Ⅰ抗(小鼠抗人HBsAg單克隆抗體工作液，小鼠抗人HBcAg單克隆抗體工作液，小鼠抗人HBeAg單克隆抗體稀釋度1∶30)，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育60 min，陰性對照采用PBS代替Ⅰ抗；PBS沖洗3次，每次5 min，以除去未結(jié)合的Ⅰ抗，滴加Envision聚合物，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育20 min；PBS沖洗3次，每次5 min，DAB顯色3 min，置顯微鏡下觀察，控制顯色程度，清水沖洗暫停反應(yīng)10 min；蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min，清水返藍(lán)5 min；95%乙醇水化1 min，置于55 ℃烤箱1 h；二甲苯透明5 min，中性樹脂封固。

采用2例慢性活動性乙型肝炎肝組織作為陽性對照組。

2.4結(jié)果判定根據(jù)2000年腎活檢病理診斷標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)意見[2]：腎小球內(nèi)抗原沉積視為陽性。在光鏡下見淡黃色細(xì)顆粒視為弱陽性(+)，棕黃色顆粒視為陽性(++),褐黃色粗顆粒視為強陽性(+++)[4]。

3統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法，配對計數(shù)資料比較采用McNemar檢驗，計數(shù)資料相關(guān)性分析采用雙變量Spearman等級相關(guān)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　　果

14種抗原的定位與分布

PreS1/S2-Ag陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒，在腎臟中主要表現(xiàn)為胞漿型，陽性細(xì)胞呈局灶型分布，陽性細(xì)胞可見于腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及腎小球上皮細(xì)胞；HBsAg和HBeAg陽性物質(zhì)與preS1/S2-Ag類似，也表現(xiàn)為胞漿型。HBcAg陽性物質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，主要位于核內(nèi)，部分病例位于胞漿內(nèi)或核漿聯(lián)合存在，少數(shù)位于胞膜上,見圖1～4。

Figure 1. Expression of preS1/S2-Ag in renal tissues of patients with HBV-GN (immunohistochemical staining). A: PBS control (×400); B: positive expression of preS1/S2-Ag (×100).

圖1PreS1/S2-Ag在腎組織中的表達(dá)

Figure 2. The positive expression of HBsAg in glomeruli (immunohistochemical staining,×400).

圖2HBsAg在腎小球的陽性表達(dá)

Figure 3. The positive expression of HBcAg in renal tissues (immunohistochemical staining).A:×100;B:×400.

圖3HBcAg在腎組織的陽性表達(dá)

Figure 4. The positive expression of HBeAg in renal tissues (immunohistochemical staining).A:×100;B:×400.

圖4HBeAg在腎組織中的陽性表達(dá)

249例患者抗原檢出情況

采用免疫組化檢測腎組織中乙型肝炎病毒相關(guān)抗原，preS1/S2-Ag陽性16例，陽性率32.7%，HBeAg陽性19例，陽性率38.8%，HBsAg陽性7例，陽性率14.3%，HBcAg陽性23例，陽性率46.9%；preS1/S2-Ag與HBcAg檢出率有顯著差異(P<0.01)，且相關(guān)分析顯示preS1/S2-Ag的檢出與HBcAg呈正相關(guān)(P<0.01)，其余無相關(guān)性，見表1。

表1患者HBeAg、HBsAg和HBcAg檢出率與preS1/S2-Ag檢出率的比較及相關(guān)性分析

Table 1. Comparison and correlation analysis of HBeAg, HBsAg and HBcAg positive rates with preS1/S2-Ag positive rate in patients(n=49)

HBVantigen+-Positiverate(%)Comparison(vspreS1/S2?Ag)Correlation(vspreS1/S2?Ag) 2PrPPreS1/S2?Ag163332．7HBeAg193038．80．248>0．050．071>0．05HBsAg74214．30．000>0．050．036>0．05HBcAg232646．912．55<0．010．459<0．01

3病理類型與抗原檢出的關(guān)系

在49例入選病例中4種抗原至少有1項檢測為陽性的有36例，4種抗原均為陰性的有13例。根據(jù)抗原檢出情況我們將49例患者分為陽性組(即HBV-GN組)和陰性組(即腎炎合并HBV感染組)，病理類型統(tǒng)計如下：HBV-GN組總計36例，其中MN 14例， IgAN 8例，SPGN 6例，MPGN 4例，MsPGN 3例，MCD 1例;腎炎合并HBV感染組總計13例，其中MN 3例，SPGN 2例，IgAN 5例，MCD 1例，MPGN 2例，MsPGN 0例。病理類型與HBV抗原表達(dá)無明顯相關(guān)性(r=0.176，P>0.05)。

在49例乙肝病毒感染合并腎炎的患者中，4種抗原總體檢出率膜性腎病82.4%，膜增生性腎病66.7%，IgA腎病61.5%，系膜增生性腎炎100%，輕微病變50%，增生硬化性腎病75%。由于病例數(shù)較少，各病理類型各種抗原檢出率差異性未做統(tǒng)計分析,見表2。

4乙肝相關(guān)性腎炎與其它腎病各抗原表達(dá)情況的比較

將確診乙肝腎炎的36例患者與5例其它腎病的患者進(jìn)行比較，其它腎病組有2例表達(dá)HBeAg，1例表達(dá)HBcAg，無1例表達(dá)preS1/S2-Ag及HBsAg，見表3。

討　　論

HBV的外膜由S-ORF編碼合成，包括3種外膜成分：大蛋白、中蛋白和主蛋白HBsAg。主蛋白HBsAg由226個氨基酸組成，中蛋白是在主蛋白的氨基端外加55個氨基酸，擴加部分為preS2，大蛋白是在中蛋白的氨基端再增加119個氨基酸，增加部分即為preS1[5]。PreS1蛋白暴露于病毒表面，是與肝細(xì)胞膜接觸的前哨[6],有多個B細(xì)胞及T細(xì)胞表位[7]。針對這些抗原表位已制作出多種多、單克隆抗體，目前商品化抗體中較容易獲得的是preS1/S2(1～176 aa)，其攜帶的抗原表位最多，因此我們選用該試劑對腎組織中的preS1/S2抗原進(jìn)行了檢測。

表249例入選病例各病理類型的抗原檢出情況

Table 2. Antigen detection in the 49 cases of patients with diffe-rent pathological types

PathologicaltypePreS1/S2?Ag，HBeAg，HBsAgorHBcAgpositivePreS1/S2?Ag，HBeAg，HBsAgandHBcAgnegativeTotalMPGN426MN14317IgAN8513MCD112MsPGN303SPGN628Total361349

r=0.176,P>0.05. Due to fewer cases, unable to carry out various types of pathology detection rate among the comparison.

表3乙肝相關(guān)性腎炎與其它腎病各抗原表達(dá)情況的比較

Table 3. Comparison of various antigen expression in patients with hepatitis B virus-associated glomerulonephritis and other nephropathies

　GroupPreS1/S2?AgHBeAgHBsAgHBcAg+-+-+-+-HBV?GN162019177292313MCD05050505Others05230514

MCD (non-hepatitis B group): 5 cases of glomerular minimal-change disease; others (non-nephritis group): 5 cases of other nephropathies (kidney cancer or kidney stone disease).

我們對49例HBV血清學(xué)陽性的患者應(yīng)用免疫組化的方法檢測腎組織中preS1/S2-Ag與HBsAg和HBeAg的一致性較好，但檢出率低于HBcAg。實驗結(jié)果中，36例HBV-GN腎組織中preS1/S2-Ag陽性，陽性顆粒主要存在于腎小管的上皮細(xì)胞胞漿中，而在腎小球內(nèi)皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞及上皮細(xì)胞胞漿中也可見表達(dá)。PreS1/S2-Ag的檢出陽性率為32.7%，與其它傳統(tǒng)HBV抗原HBsAg(陽性率14.3%)和HBeAg(陽性率38.8%)比較無明顯差異，提示preS1/S2-Ag與HBsAg、HBeAg的一致性較好，而與HBcAg(陽性率46.9%)比較，檢出率有顯著差異；在與其它3種抗原的關(guān)聯(lián)性分析中發(fā)現(xiàn)，preS1/S2-Ag與其它HBV抗原總的檢出率存在關(guān)聯(lián)，且與HBcAg相關(guān)性較強。HBcAg存在于細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞內(nèi)抗原，僅在細(xì)胞受損時才從胞內(nèi)釋出，因此腎組織中存在HBcAg難以用來自于血液循環(huán)中的抗原或抗原抗體復(fù)合物沉積解釋[8-10]，故對HBV-GN的診斷意義較大。在5例HBsAg血清學(xué)陰性腎小球輕微病變患者腎組織中并沒有檢出preS1/S2-Ag及其它HBV抗原。在5例其它非腎小球腎炎患者腎組織中有2例HBsAg陽性，1例HBcAg陽性，沒有檢出preS1/S2-Ag。綜合上述結(jié)果說明preS1/S2-Ag可以在腎臟中存在，可能是導(dǎo)致HBV-GN發(fā)生的致病抗原之一。當(dāng)然，本研究中preS1/S2-Ag并未顯示較高的敏感性，可能有幾方面的原因：一是可能選擇的preS1/S2-Ag抗體是多克隆抗體，其它抗體采用的是單克隆抗體，抗原抗體結(jié)合的效能沒有優(yōu)勢；二是選擇的preS1/S2-Ag抗體針對的區(qū)段為1～176位氨基酸，這種抗體在包含preS1的抗體中是否反應(yīng)原性最優(yōu)，目前尚無定論。但在膜性腎病組中，有1例患者4種抗原檢測僅preS1/S2-Ag檢出，提示對這類患者聯(lián)合preS1/S2-Ag檢測或可提高診斷的敏感性。

HBV-GN的病理類型，兒童以膜性腎病為主，成人以膜性和膜增生性腎病為主[3]。我們的研究在49例患者中檢出至少1項抗原陽性有36例，根據(jù)1989年及2000年病理診斷標(biāo)準(zhǔn)，該36例病人可視為HBV-GN。我們觀察到在36例HBV-GN的病理類型組成中，以膜性腎病比例最高，占38.9%，與文獻(xiàn)報道一致[3]，膜增生性腎小球腎炎在我們的研究中比例僅為11.1%。在14例膜性腎病中preS1/S2-Ag、HBeAg和HBcAg的陽性檢出率分別為35.7%(5/14)、50.0%(7/14)和64.3%(9/14)。一般認(rèn)為膜性腎病主要是由HBeAg原位免疫復(fù)合物在基底膜的沉積所致[3]。因此，我們認(rèn)為對于HBV腎病HBeAg是重要的致病抗原，應(yīng)重視對它的檢測。HBV膜性腎病與原發(fā)性膜性腎病不同，通?？梢娤的ぜ?xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的增生，系膜區(qū)增寬。PreS1不僅具有較強的免疫原性，同時具有反式轉(zhuǎn)錄激活功能[11-12]，不排除存在一條通過preS1的反式激活效應(yīng)導(dǎo)致系膜細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增殖的途徑可能，但這需要進(jìn)一步研究證實。

研究結(jié)果提示4種抗原在HBV相關(guān)IgA腎病(HBV-associated IgA nephritis，HBV-IgAN)中均有檢出，preS1/S2-Ag和HBsAg陽性患者HBcAg均可檢出，但陽性率低于后者，HBeAg則與HBcAg有較好互補性。近年HBV-IgAN相關(guān)的研究呈上升趨勢，方一卿等[10]的研究中68例HBV-GN患者，IgA腎病(51.5%)比例高于膜性腎病(38.2%)。在我們的研究中IgA腎病占22.2%，僅次于膜性腎病38.9%。近年來研究認(rèn)為HBV感染與IgA腎病關(guān)系密切，汪年松等[13]調(diào)查了100例IgAN患者，血清HBsAg陽性18例(18%)均高于普通人群的HBsAg攜帶率。其后對168例IgA腎病患者進(jìn)行檢測中，血清HBsAg陽性32例(19.05%)；腎組織HBAg 陽性59例(35.12%)，HBV-Ag在腎小球中檢出的陽性率為30.36%(51/168)[14]。循環(huán)免疫復(fù)合物(circulating immune complex，CIC)沉積在HBV-IgAN發(fā)病機制中得到較為一致的公認(rèn)。研究認(rèn)為，HBV感染人體后，可能與其體內(nèi)的血清抗體在血循環(huán)中形成免疫復(fù)合物，主要為HBsAg-CIC和HBcAg-CIC。HBsAg和HBcAg的相對分子質(zhì)量較大，帶負(fù)電荷，其CIC無法穿透腎小球基底膜而沉積于上皮下，故CIC主要沉積在系膜區(qū)和內(nèi)皮下。HBeAg分子量小，且HBeAg相關(guān)免疫復(fù)合物在血液中可以暫時解離，故HBeAg容易直接穿過腎小球基底膜種植于上皮下，與循環(huán)中的相應(yīng)抗體在上皮下結(jié)合，形成原位免疫復(fù)合物[3]。本研究中8例IgA腎病患者中4例檢出HBeAg，或可認(rèn)為原位免疫復(fù)合物沉積也可能是參與HBV-IgAN致病的因素。

本研究是回顧性收集患者的臨床資料，故部分患者資料不夠完整。研究中以免疫組化對preS1/S2-Ag等HBV相關(guān)抗原的表達(dá)進(jìn)行了檢測，若能從電鏡、原位雜交、Southern印跡雜交等多角度印證實驗，則結(jié)果將更為嚴(yán)謹(jǐn)。今后可從基礎(chǔ)研究的角度進(jìn)一步探討preS1/S2-Ag對腎臟致病的機制研究。

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