張 良，代 維，高志明，周繼紅，劉大維

缺血再灌注(ischemia reperfusion，IR)損傷是創(chuàng)傷后常見的嚴(yán)重繼發(fā)性組織損傷之一，在肢體的創(chuàng)傷、斷肢再植、血栓形成、組織移植以及止血帶的應(yīng)用時間過長均等經(jīng)?？捎鲆?。它不僅影響缺血組織器官的存活及功能，而且可累及全身多器官，嚴(yán)重時可引發(fā)多器官功能衰竭而導(dǎo)致患者死亡。血必凈是一種臨床上用于由感染(膿毒癥)、嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征的器官功能受損期及衰竭早期患者的中藥注射制劑，有臨床文獻(xiàn)證實(shí)血必凈能有效控制炎癥遞質(zhì)、改善凝血功能等［1－3］。我們分析推測血必凈可能對缺血再灌注組織損傷有一定的防治作用，然而目前尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)。為此，本研究采用兔下肢缺血再灌注損傷模型，以觀察血必凈注射液對缺血再灌注組織損傷的防治作用和機(jī)制。

材料與方法

1 動物模型及分組

新西蘭大耳兔20只，體重2.10～2.30kg，雌雄不拘，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只。術(shù)前12h禁食，200g/L烏拉坦5ml/kg耳緣靜脈注射麻醉。腹股溝及雙下肢剪毛、碘伏消毒，于左股三角處暴露左股靜脈，置入22#靜脈留置針，肝素封管，用于采集血樣本。

參照Crinnion等［4］方法建立肢體缺血再灌注損傷動物模型:于右股三角處暴露右股動、靜脈，分離股神經(jīng)，用微血管夾夾閉股動、靜脈。然后用縫線沿腹股溝環(huán)扎肢體，阻斷側(cè)支循環(huán)，造成肢體完全缺血。6h后松開縫線及血管夾，恢復(fù)股動、靜脈血流。實(shí)驗(yàn)組于恢復(fù)血流后按每公斤體重抽取4ml血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z2004003)，用生理鹽水配至10ml，緩慢靜脈推注;對照組在恢復(fù)血流后給予10ml生理鹽水，緩慢靜脈推注。

2 樣本采集及觀察指標(biāo)

于麻醉后30min及松開血管夾后1、2、4、6h 5個時相點(diǎn)采取靜脈血樣本6ml。分別測定凝血功能:活化部分凝血酶時間(APTT)、纖維蛋白原檢測(FIB)、國際標(biāo)準(zhǔn)比率(PT-INR)、凝血酶原時間(PT);血漿生化:白蛋白(ALB)、血清乳酸脫氫酶(LDH)、血清肌酸激酶(CK);自由基相關(guān)指標(biāo):丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。6h后放血活殺，取右側(cè)股直肌標(biāo)本，進(jìn)行組織病理切片蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察，并分別做組織勻漿測定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)含量、干濕比。其中凝血功能、生化項(xiàng)目由大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科專人單盲檢測完成;MDA、SOD、TNF-α、IL-6含量采用碧云天公司試劑盒在美國Gene公司自動酶標(biāo)儀上測定。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

1 凝血功能變化(表1)

對照組再灌注后靜脈血APTT逐漸增加，2h和4h時明顯高于再灌注前(P＜0.01)，4h時達(dá)到再灌注前的149.54%，6h時恢復(fù)至再灌注前水平。實(shí)驗(yàn)組再灌后APTT低于對照組，最高值出現(xiàn)在2h，為再灌注前的128.36%，明顯高于再灌注前(P＜0.05);4h時即恢復(fù)至再灌注前的水平，在1h和4h時非常顯著低于對照組(P＜0.01)。

對照組FIB在缺血再灌注前后變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，實(shí)驗(yàn)組再灌注后4、6h FIB含量均顯著高于再灌注前(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，各時相點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

再灌注后2h兩組PT_INR最高，對照組再灌注后與再灌注前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組再灌注后2h PT_INR(0.93±0.05)非常顯著高于再灌注前(0.87±0.03，P＜0.01)，實(shí)驗(yàn)組與對照組各時相點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

再灌注后2h各組PT最高，對照組再灌注后與再灌注前差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);實(shí)驗(yàn)組再灌注后2h、4h PT顯著高于再灌注前(P＜0.05)，實(shí)驗(yàn)組與對照組各時相點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2 靜脈血生化項(xiàng)目檢測(表2)

兩組動物在缺血再灌注后，ALB呈逐漸下降趨勢，均在再灌注后4h達(dá)到最低值，且顯著低于再灌注前(P＜0.05)。對照組再灌注后1～6h均顯著低于再灌注前(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組再灌注后1h與再灌注前差異不顯著(P＞0.05)，2～6h顯著低于再灌注前(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

兩組動物再灌注后AST含量較再灌注前有所升高，除對照組再灌注6h與再灌注前無差異(P＞0.05)，其他各時相點(diǎn)均顯著高于再灌注前(P＜0.05);兩組AST峰值均出現(xiàn)在再灌注后2h，隨后有所下降。實(shí)驗(yàn)組再灌注后6h AST顯著高于對照組(P＜0.05)。

兩組動物再灌注后LDH含量較再灌注前有非常顯著的升高(P＜0.01)，并在再灌注后2h達(dá)到高峰，隨后有所下降;2h時對照組LDH含量［(434.86±26.62)U/L］非常顯著高于實(shí)驗(yàn)組［(331.51±43.67)U/L，P＜0.01］;實(shí)驗(yàn)組再灌注后1、2、4h LDH含量均非常顯著低于對照組(P＜0.01)。

兩組再灌注后CK含量均非常顯著高于再灌注前(P＜0.01)，并在再灌注后2h達(dá)到高峰，再灌注后4h有所下降。實(shí)驗(yàn)組再灌注后1、4h的CK含量均顯著低于對照組(P＜0.05)。

3 靜脈血MDA和SOD變化(表3)

兩組MDA含量在再灌注后1h最高，且顯著高于再灌注前(P＜0.05)，隨后MDA含量逐漸下降，僅對照組2h非常顯著高于再灌注前(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組再灌注后2h MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05)。

兩組再灌注后SOD活性均高于再灌注前，差異非常顯著(P＜0.01)。對照組再灌注后4h活性最高(63.32±4.87)NM/ml;實(shí)驗(yàn)組再灌注后2h活性最高(66.93±4.96)NM/ml，實(shí)驗(yàn)組再灌注后1～4h活性顯著高于對照組(P＜0.05)。

4 股直肌TNF-α、IL-6及干濕比比較(表4)

對照組與實(shí)驗(yàn)組股直肌內(nèi)TNF-α、IL-6、干濕比等3個指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

5 組織病理觀察

在再灌注6h后，對照組缺血再灌注側(cè)股直肌的肌纖維紊亂，有斷裂和壞死區(qū)域，可見少量白細(xì)胞浸潤(圖1);實(shí)驗(yàn)組可見肌纖維條理清晰，未見明顯壞死肌纖維，可見少量白細(xì)胞浸潤(圖2)。

表1 兩組的凝血功能指標(biāo)變化(±s)

表1 兩組的凝血功能指標(biāo)變化(±s)

與對照組比較:＊＊P＜0.01;與缺血再灌注前比較:#P＜0.05，##P＜0.01

項(xiàng)目 組別 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h APTT(s) 對照組 26.95±3.76 30.41±3.80 36.90±9.10## 40.30±12.78##25.37±5.90實(shí)驗(yàn)組 25.46±4.59 24.82±2.38＊＊32.68±6.84# 25.20±4.79＊＊ 22.56±2.97 FIB(g/L) 對照組 3.83±0.54 3.89±0.65 3.69±0.42 3.89±0.70 3.89±0.57實(shí)驗(yàn)組 3.40±0.48 3.41±0.38 3.42±0.45 3.85±0.59# 4.02±0.57#PT_INR 對照組 0.89±0.05 0.88±0.04 0.91±0.04 0.88±0.03 0.87±0.03實(shí)驗(yàn)組 0.87±0.03 0.86±0.02 0.93±0.05## 0.89±0.03 0.86±0.04 PT(s) 對照組 10.82±0.73 10.55±0.59 11.02±0.58 10.70±0.50 10.48±0.43實(shí)驗(yàn)組 10.43±0.34 10.42±0.36 11.44±0.74## 10.86±0.40#10.34±0.61

表2 兩組的靜脈血生化項(xiàng)目比較(±s)

表2 兩組的靜脈血生化項(xiàng)目比較(±s)

與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺血再灌注前比較:#P＜0.05;##P＜0.01

項(xiàng)目 組別 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h ALB(g/L)對照組 14.38±1.22 12.87±1.15# 12.09±1.47## 11.95±1.27## 10.57±1.49##實(shí)驗(yàn)組 15.36±2.17 13.64±1.90 13.00±1.70# 12.81±1.45## 11.23±1.40##LDH(U/L)對照組 119.27±12.78 398.51±27.12## 434.86±26.62## 367.29±29.73## 312.86±44.84##實(shí)驗(yàn)組 116.50±11.63 306.46±45.16＊＊## 331.51±43.67＊＊## 314.88±48.44＊＊## 295.08±31.07##CK(U/L)對照組1658.34±110.46 3621.59±314.27## 3755.51±493.39## 3337.91±326.98## 2961.26±213.72##實(shí)驗(yàn)組1674.75±130.56 3324.00±217.28*## 3429.92±274.80## 3041.92±253.77*## 2909.95±276.11##AST(U/L)對照組 45.34±9.37 64.42±19.61# 76.96±14.37## 63.25±12.43## 50.56±9.48實(shí)驗(yàn)組 41.15±9.68 61.81±7.70## 71.97±13.67## 63.78±7.11## 61.08±7.96*##

表3 兩組的靜脈血MDA和SOD變化(±s)

表3 兩組的靜脈血MDA和SOD變化(±s)

與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與缺血再灌注前比較:#P＜0.05，##P＜0.01

項(xiàng)目 組別 再灌注前 再灌注后1h 再灌注后2h 再灌注后4h 再灌注后6h MDA(μM)對照組 31.16±0.71 34.15±2.26## 33.84±2.61##32.05±2.41 31.35±1.25實(shí)驗(yàn)組 31.19±1.02 32.77±1.91# 31.65±1.57* 30.80±1.26 30.27±1.08 SOD(NM/ml)對照組 38.32±2.62 49.85±3.70## 53.21±5.61## 63.32±4.87## 48.90±2.86##實(shí)驗(yàn)組 38.09±2.34 58.61±5.74＊＊## 66.93±4.96＊＊## 57.21±5.83*## 52.90±5.74##

表4 股直肌TNF-α和IL-6含量及干濕比比較(±s)

表4 股直肌TNF-α和IL-6含量及干濕比比較(±s)

TNF-α(pg/ml)IL-6(pg/ml)干濕比對照組8.40±0.74 13.90±3.9 0.26±0.02實(shí)驗(yàn)組8.40±1.68 12.54±3.0 0.27±0.02

圖1 對照組股直肌病理切片(HE×20)

圖2 實(shí)驗(yàn)組股直肌病理切片(HE×20)

討 論

肢體缺血再灌注損傷是創(chuàng)傷后常見的嚴(yán)重繼發(fā)性組織損傷，可導(dǎo)致組織水腫、筋膜間隔綜合征、肌纖維攣縮等，嚴(yán)重影響肢體功能恢復(fù)，甚至造成肢體的殘疾，同時也可造成全身各重要器官及系統(tǒng)不同程度的損傷，對傷員的生命和愈后有著重大的影響。因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制，尋找方便、高效的救治措施有著重要的意義。我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥中的活血化瘀、改善循環(huán)、消炎抗毒等相關(guān)方劑在減輕組織損傷等方面起到明顯的作用，能夠有效緩解肢體IR損傷，提示中醫(yī)藥在創(chuàng)傷救治方面有著巨大的潛在價(jià)值。

血必凈是由中藥紅花、赤芍、川芎、丹參、當(dāng)歸等是提取的中藥制劑，臨床上常用于由感染(膿毒癥)、嚴(yán)重創(chuàng)傷和燒傷等引起的多器官功能障礙綜合征的器官功能受損期及衰竭早期患者，臨床治療效果良好。已有臨床文獻(xiàn)證實(shí)血必凈能有效控制炎癥介質(zhì)、改善凝血功能等［1－3］;以及抑制心肌細(xì)胞鈣超載，減輕心肌損傷等作用［5－6］。同時，有研究表明血必凈的主要成份川芎、丹參等具有清除氧自由基的功能［7］。因此，我們推測中藥制劑對缺血再灌注損傷可能有效好的治療價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，血必凈注射液對動物肢體缺血再灌注后的凝血功能有一定的調(diào)節(jié)作用。具體表現(xiàn)在:實(shí)驗(yàn)組再灌注損傷后1h和4h的APTT延長情況較對照組有明顯改善(P＜0.01);PT較灌注前有明顯的延長(P＜0.05)。另外，再灌注損傷可造成紅細(xì)胞膜膜磷脂分子過氧化損傷，引起紅細(xì)胞膜流動性乃至整個細(xì)胞變形性明顯惡化，嚴(yán)重時嵌頓于毛細(xì)血管導(dǎo)致微循環(huán)障礙，使組織缺血缺氧。而FIB能吸附于紅細(xì)胞表面，遮蔽其表面電荷而降低紅細(xì)胞間的靜電斥力，使紅細(xì)胞聚集性增加［8］。實(shí)驗(yàn)組再灌注后4、6h FIB含量較再灌前有顯著增高(P＜0.05)，提示血必凈注射液可能有助于缺血再灌注后對凝血功能的維護(hù)和改善，有助于改善微循環(huán)的障礙。

肢體缺血再灌注后，由于缺血再灌注組織細(xì)胞中會產(chǎn)生大量氧自由基，并釋放出大量炎性遞質(zhì)如白細(xì)胞三烯B4和血栓素A2、緩激肽、NO、內(nèi)皮素等血管活性物質(zhì)，這些均能使毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、通透性增加。隨著毛細(xì)血管的通透性增加，使血中小分子蛋白滲漏到組織間隙，導(dǎo)致血中ALB水平降低，組織細(xì)胞水腫［9］。因此血中ALB降低的程度也間接反應(yīng)了缺血再灌注損傷的程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)再灌注后，實(shí)驗(yàn)組和對照組ALB含量均呈進(jìn)行性下降(P＜0.01)，但實(shí)驗(yàn)組再灌注后1h ALB含量與再灌注前無差異(P＞0.05)。提示血必凈注射液可能具有改善毛細(xì)血管通透性，減輕組織細(xì)胞水腫，延緩ALB滲漏的作用。

正常肌細(xì)胞內(nèi)富含AST、LDH、CK等蛋白酶，細(xì)胞受損后，酶即釋放入血。通常血清中這些酶含量的高低可反映細(xì)胞損傷的程度，可作為反映肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，再灌注后，實(shí)驗(yàn)組AST含量1～4h與對照組無差異(P＞0.05)，6h時顯著高于對照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組LDH含量在再灌注后1～4h非常顯著低于對照組(P＜0.01);實(shí)驗(yàn)組CK含量在再灌注后1、4h顯著低于對照組(P＜0.05)。提示血必凈注射液可能在肢體缺血再灌注損傷早期對肌肉組織細(xì)胞的損傷有一定的保護(hù)作用。

氧自由基可使細(xì)胞膜迅速去極化，破壞膜功能，還可與細(xì)胞膜脂質(zhì)反應(yīng)生成脂質(zhì)過氧化物(LPO)［10］。MDA和SOD是反映脂質(zhì)過氧化程度的一對指標(biāo)，MDA為LPO的一種，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映細(xì)胞損傷的程度。SOD對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要作用，此酶能清除超氧化物陰離子，防護(hù)細(xì)胞免受損傷，SOD的測定能反映組織內(nèi)自由基水平及脂質(zhì)過氧化程度。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組再灌后2h MDA含量顯著低于對照組(P＜0.05);實(shí)驗(yàn)組再灌注后1～4h SOD活性均顯著高于對照組(P＜0.05)。提示應(yīng)用血必凈注射液后可減弱自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，減輕細(xì)胞損傷程度，增強(qiáng)清除自由的基能力。

股直肌再灌注后6h實(shí)驗(yàn)組與對照組間TNF-α、IL-6、干濕比等指標(biāo)差異均不顯著(P＞0.05)，可能是再灌注后6h肌體由缺血再灌注損傷狀態(tài)下恢復(fù)程度相近，導(dǎo)致差異不顯著。

病理切片顯示對照組和實(shí)驗(yàn)組再灌注后6h肌組織均出現(xiàn)白細(xì)胞浸潤，但實(shí)驗(yàn)組肌纖維條理清晰，無明顯異常，對照組有肌纖維紊亂，出現(xiàn)斷裂和壞死區(qū)域。提示血必凈注射液對肌組織有一定保護(hù)作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)使用中藥制劑血必凈注射液治療可以調(diào)節(jié)肢體缺血再灌注損傷后機(jī)體凝血功能，減輕微循環(huán)障礙，降低毛細(xì)血管通透性，減輕肌組織細(xì)胞再灌注損傷，抑制氧自由基的產(chǎn)生、減少LPO的形成，從而對肢體缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

［1］姚莉，周小妹，王漢明，等.血必凈注射液對凝血功能障礙膿毒癥患者的臨床研究［J］.中華全科醫(yī)學(xué)，2011，9(7):1032－1034.

［2］張慶洋，孫建平.血必凈對嚴(yán)重?zé)齻颊咴缙谌硌装Y反應(yīng)的影響［J］.中華燒傷雜志，2011，27(3):183－184.

［3］歸詠剛，姚詠明，柴艷芬.血必凈注射液對膿毒癥大鼠白細(xì)胞介素－6表達(dá)及血小板的影響［J］.中國急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學(xué)雜志，2009，4(1):13－16.

［4］Crinnion JN，Homer－Vanniasinkam S，Parkin SM，et al.Role of neutrophil－endothelial adhesion in skeletal muscle reperfusion injruy［J］.Br J Surg，1996，83(2):251－254.

［5］余中方，呂雪峰，張建.血必凈治療窒息新生兒心肌損傷32例總結(jié)［J］.湖南中醫(yī)雜志，2011，27(2):8－9.

［6］周厚榮，張謙，劉海健，等.血必凈注射液對窒息模型大鼠復(fù)蘇后心功能、心肌細(xì)胞鈣離子變化的影響［J］.中國藥房，2009，20(33):2564－2566.

［7］何國鑫，胡慧敏，羅文朝，等.血必凈注射液對急性肺損傷大鼠氧自由基變化的影響［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2009，25(12):1916－1919.

［8］Huang YM，Zhao H，Yu X，et al.Damaging mechanism of free radical to the membrane molecules of red blood cell［J］.Acta Biophys Sin，1997，13(2):315－323.

［9］于蓉，岑瑛，劉小雪，等.丹參對兔肢體缺血再灌注損傷的影響［J］.華西醫(yī)學(xué)，2002，17(2):238－239.

［10］Korompilias AV，Chen LE，Seaber AV，et al.Studies of ischemia－reperfusion injury in skeletal muscle:efficacy of 21－aminosteroids on microcirculation and muscle contraction after an extended period of warm ischemia［J］.J Orthop Res，1997，15(4):512.