胡四平 汪衛(wèi)星 劉洋 吳鶴芬 余亮 劉鶴 王翔

局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對(duì)脛骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響

胡四平 汪衛(wèi)星 劉洋 吳鶴芬 余亮 劉鶴 王翔

目的 觀察局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利對(duì)脛骨癌痛的緩解作用。 方法 選取32只雌性SD大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，空白對(duì)照組（Cont組）、假手術(shù)組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）和骨癌痛聯(lián)合阿米洛利組（A組），各8只。BCP組和A組大鼠在脛骨上端骨髓腔內(nèi)注射5μl Walker-256乳腺癌細(xì)胞制備脛骨癌痛模型，建模成功后第7天于脛骨上端區(qū)分別注射0．9%氯化鈉溶液和阿米洛利溶液各100μl；Sham組大鼠脛骨上端骨髓腔內(nèi)注射等體積Hank液，并于相同時(shí)間點(diǎn)在脛骨上端區(qū)注射0．9%氯化鈉溶液100μl。分別于注射Walker-256乳腺癌細(xì)胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0．9%氯化鈉溶液后30min（T2）、1 h（T3）、2 h（T4）、4 h（T5）、8 h（T6）時(shí)檢測(cè)各組大鼠機(jī)械縮足閾值（MWT）和自由行走疼痛評(píng)分。 結(jié)果 與T0比較，BCP組和A組各時(shí)點(diǎn)MWT值、自由行走疼痛評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時(shí)點(diǎn)MWT值、自由行走疼痛評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與BCP組比較，A組T2～T5MWT值、自由行走疼痛評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；與T1時(shí)比較，A組T2～T5MWT值、自由行走疼痛評(píng)分的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論 局部注射酸敏感離子通道抑制劑阿米洛利可有效緩解脛骨癌痛大鼠的疼痛行為。

骨腫瘤 疼痛 阿米洛利

既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤組織參與疼痛的進(jìn)展，其分子機(jī) 制十分復(fù)雜且不明確[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)，初級(jí)感覺神經(jīng)元上的酸敏感離子通道（acid sensing ion channels，ASICs）可由癌癥骨轉(zhuǎn)移形成的酸性微環(huán)境激活產(chǎn)生疼痛信號(hào)[2]。阿米洛利（amiloride）作為ASICs的非選擇性抑制劑，可以明顯緩解急性和慢性炎性疼痛[3-4]，但其對(duì)癌痛的影響尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠脛骨癌痛模型，觀察局部注射阿米洛利對(duì)骨癌痛大鼠疼痛行為學(xué)的影響，為臨床骨癌痛的治療提供新思路和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 成年健康雌性Sprague-Dawley大鼠32只，體重160～180 g，由浙江大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠靜養(yǎng)適應(yīng)1周，晝夜交替照明（8∶00～20∶00），室溫21～25℃，濕度40%～60%，自由攝食、飲水。Walker-256腫瘤細(xì)胞（中國(guó)上海生物醫(yī)學(xué)工程研究所），Von Frey纖絲（美國(guó)Stoelting公司），阿米洛利（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 方法 按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組，空白對(duì)照組（Cont組）、假手術(shù)組（Sham組）、骨癌痛組（BCP組）和骨癌痛聯(lián)合阿米洛利組（A組），每組各8只。BCP組和A組大鼠參照文獻(xiàn)[5]方法制備脛骨癌痛模型，采用體外培養(yǎng)Walker-256乳腺癌細(xì)胞，密度為2×107/ml。10%水合氯醛0.4ml/kg腹腔注射麻醉大鼠，右側(cè)后肢剪毛、消毒皮膚，切開皮膚暴露脛骨上端，針尖在脛骨干骺端穿刺打孔后，微量注射器刺入骨髓腔緩慢注射5μl Walker-256乳腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)液，注射后骨蠟迅速封堵針孔并涂抹醫(yī)用膠水，消毒后組層縫合切口，局部涂抹紅霉素眼膏預(yù)防感染。Sham組大鼠右側(cè)脛骨注射等體積Hank液，其余操作同上。建模成功后第7天BCP組與A組于脛骨上端分別注射0.9%氯化鈉溶液和阿米洛利溶液100μl，Sham組注射0.9%氯化鈉溶液100μl，Cont組不做任何處理。

1.3 機(jī)械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold，MWT）測(cè)定 將有機(jī)玻璃箱置于鐵絲網(wǎng)格上，大鼠置于有機(jī)玻璃盒預(yù)適應(yīng)30min，以不同力度的Von Frey纖毛刺激大鼠足底，按照升序從1g開始，最大刺激力度為26g。以纖毛稍稍彎曲作為完全受力標(biāo)準(zhǔn)，持續(xù)刺激5s，連續(xù)5次，每次至少間隔30s，大鼠出現(xiàn)抬足或舔足行為為陽(yáng)性反應(yīng)。若3次不抬腿，換高一級(jí)克數(shù)的纖毛；有3次抬腿，則返回低一級(jí)克數(shù)的纖毛，直到每5次測(cè)試中有3次抬腿。5次中能夠引起3次抬腿的最低Von Frey纖毛克數(shù)計(jì)為MWT值。分別于注射Walker-256乳腺癌細(xì)胞或Hank液前1天（T0）、注射后第7天（T1）、注射阿米洛利或0.9%氯化鈉溶液后30min（T2）、1h（T3）、2h（T4）、4h（T5）、8h（T6）時(shí)測(cè)定各組大鼠MWT值。

1.4 自由行走疼痛評(píng)分 參照文獻(xiàn)[5]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)觀察大鼠自由行走疼痛行為：0分，大鼠行走正常；1分，造模側(cè)后肢使用正常，輕度跛行；2分，介于1分和3分之間；3分，造模側(cè)后肢嚴(yán)重跛行；4分，造模側(cè)后肢不能著地。1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠MWT值的比較 與T0比較，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)MWT值較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Cont組和Sham組各時(shí)點(diǎn)間MWT值的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)MWT值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而Sham組各時(shí)間點(diǎn)MWT值無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與BCP組比較，A組T2～T5MWT值較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T1時(shí)無(wú)明顯差異（P＞0.05））；與T1比較，A組T2～T5MWT值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)MWT比較（與T0比較，*P＜0.05；與Cont組比較，#P＜0.05；與BCP組比較，§P＜0.05；與T1時(shí)比較，△P＜0.05）

2.2 各組大鼠自由行走疼痛評(píng)分比較 與T0比較，BCP組和A組各時(shí)點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Cont組和Sham組各時(shí)點(diǎn)間自由行走疼痛評(píng)分的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與Cont組相比，BCP組和A組各時(shí)點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Sham組各時(shí)點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與BCP組比較，A組T2～T5自由行走疼痛評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），T1無(wú)明顯差異（P＞0.05）；與T1時(shí)比較，A組T2～T5自由行走疼痛評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

3 討論

癌癥骨轉(zhuǎn)移最常見的并發(fā)癥是骨癌痛，既嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量又易引發(fā)其他并發(fā)癥。“癌痛三階梯療法”是目前癌痛的主要治療方法，但尚有不少患者得不到有效緩解。當(dāng)患者為緩解疼痛而使用大劑量強(qiáng)效阿片類藥物治療時(shí)，極易引發(fā)嚴(yán)重的不良反應(yīng)甚至危及生命。因而，尋求有效的藥物和方法是臨床癌痛治療中關(guān)注的焦點(diǎn)。

圖2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分比較（與T0比較，*P＜0.05；與Cont組比較，#P＜0.05；與BCP組比較，§P＜0.05；與T1時(shí)比較，△P＜0.05）

局部組織酸化是癌癥骨轉(zhuǎn)移過(guò)程中重要的病理生理過(guò)程，由轉(zhuǎn)移的癌細(xì)胞、骨吸收的破骨細(xì)胞及炎癥細(xì)胞等產(chǎn)生的大量質(zhì)子而形成局部酸性微環(huán)境[6-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及人類骨癌痛的研究發(fā)現(xiàn)，破骨細(xì)胞既是骨喪失中的重要角色，也參與骨癌痛形成：破骨細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均能釋放H+維持骨腫瘤局部酸性微環(huán)境（pH 4.0～5.0），可能在骨癌痛產(chǎn)生過(guò)程具有重要作用[9]。ASICs作為質(zhì)子受體，是一種質(zhì)子門控陽(yáng)離子通道，包括7個(gè)亞單位：ASIC1a、ASIC1b、ASIC1b2、ASIC2a、ASIC2b、ASIC3和ASIC4，主要表達(dá)在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，其中ASIC1b和ASIC3大量表達(dá)在包括背根神經(jīng)節(jié)在內(nèi)的外周神經(jīng)系統(tǒng)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ASICs mRNA表達(dá)和活性可在炎癥引起的酸性條件下增加，特別是ASIC3與降鈣素基因相關(guān)肽陽(yáng)性神經(jīng)共表達(dá)在支配骨膜表面的感覺神經(jīng)元上，提示ASICs在組織酸化引起的疼痛中發(fā)揮重要作用[11]。本研究發(fā)現(xiàn)：（1）MWT值：與T0比較，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分較高；與Cont組相比，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分升高。（2）自由行走疼痛評(píng)分：與T0比較，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分較高；與Cont組相比，BCP組和A組各時(shí)間點(diǎn)自由行走疼痛評(píng)分升高。本研究結(jié)果與上述理論相符。因此，針對(duì)骨腫瘤局部酸性微環(huán)境和ASICs進(jìn)行干預(yù)，可能成為骨癌痛治療的有效靶點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，大鼠骨癌痛模型建立后第7天MWT值明顯降低，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，提示模型建立成功，故本研究選擇模型建立后第7天注射阿米洛利檢測(cè)各組大鼠MWT值變化是正確的。本研究結(jié)果顯示：（1）MWT值：與BCP組比較，A組T2～T5MWT值較高；與T1時(shí)比較，A組T2～T5MWT值升高。（2）自由行走疼痛評(píng)分：與BCP組比較，A組T2～T5自由行走疼痛評(píng)分降低；與T1時(shí)比較，A組T2～T5自由行走疼痛評(píng)分降低。該結(jié)果表明使用ASICs的抑制劑阿米洛利可以明顯抑制大鼠骨癌痛模型MWT值的降低及自由行走疼痛評(píng)分，其機(jī)制可能為阿米洛利抑制癌癥局部ASICs活性，阻斷ASICs下游信號(hào)通路，從而抑制外周疼痛信息向脊髓以上中樞傳遞，但目前本研究?jī)H從行為學(xué)上初步證實(shí)阿米洛利對(duì)大鼠骨癌痛的治療作用，其具體下游胞內(nèi)信號(hào)通路和分子機(jī)制尚有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，局部注射阿米洛利可以有效緩解大鼠脛骨癌痛，為臨床骨癌痛的治療提供新思路和理論依據(jù)。

[1]Edrinton J,Sun A,Wang C,et al．Barriers to pain management in a community sample of Chinese American patients with cancer [J]．J Pain Symptom Manage,2009,37(4):665-675．

[2]Nakanishi M,Hata K,Yoneda T．Encounter of cancer cells with bone．Molecular mechanism of cancer-induced bone pain[J]．Clin Calcium,2011,21(3):357-363．

[3]Chu X P,Papasian C J,Wang J Q,et al．Modulation of acid-sensing ion channels:molecular mechanisms and therapeutic potential[J]．Int J Physiol Pathophysiol Pharmacol,2011,3 (4):288-309．

[4]Andreev Y A,Vassilevski A A,Kozlov S A．Molecules to selectively target receptors for treatment of pain and neurogenic inflammation[J]．Recent Pat Inflamm AllergyDrug Discov,2012,6(1): 35-45．

[5]Luger N M,Sabino M A,Schwei M l,et al．Efficacy of systemic morphine suggests a fundamental difference in the mechanisms that generate bone cancer vs inflammatory pain[J]．Pain,2002, 99(3):397-406．

[6]Rousselle A V,Heyman D．Osteoclast acidification pathways during bone resorption[J]．Bone,2002,30(4):535-540．

[7]Griffiths J R．Are cancer cells acidic[J]．Br J Cancer,1991,64(4): 425-427．

[8]Gatenby R A,Gawlinski E T,Gmitro A F,et al．Acid-mediated tumor invasion:a multidisciplinary study[J]．Cancer Res,2006,66 (10):5216-5223．

[9]Spugnini E P,Citro G,Fais S．Proton pump inhibitors as anti vacuolar-ATPases drugs:a novel anticancer strategy[J]．J Exp Clin Cancer Res,2010,29(1):44．

[10]Voilley N,De Weille J,Mamet J,et al．Nonsteroid anti-inflammatory drugs inhibit both the activity and the inflammation-induced expression of acid-sensing ion channels in nociceptors [J]．J Neuroscience,2001,21(20):8026-8033．

[11]Julius D,Basbaum A I．Molecular mechanism of nociception[J]．Nature,2001,413(6852):203-210．

[12]岳冬梅,申文,陳立平,等．蛛網(wǎng)膜下腔注射甲氨蝶呤對(duì)大鼠脛骨癌痛的影響[J]．中華麻醉學(xué)雜志,2011,31(9):1065-1067．

Pain relief effect of amiloride regional injection in rat model of tibial bone cancer

Bone neoplasms Pain Amiloride

2012-12-13）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

313000 湖州市中心醫(yī)院麻醉科（胡四平、汪衛(wèi)星、劉洋、吳鶴芬、余亮），中心實(shí)驗(yàn)室（王翔）；徐州醫(yī)學(xué)院江蘇省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉鶴）

胡四平，E-mail：hsp0526@163.com

【 Abstract】Objective To assess the pain relief effect of amiloride regional injection in a rat model of tibial bone cancer pain．Methods Thirty-two female SD rats were randomly divided into 4 groups(n=8 in each group):Cont group,Sham group, bone cancer pain group(BCP group),bone cancer pain and amiloride group(A group)．Fibial bone cancer pain was induced by injection of breast cancer Walker-256 cells into marrow cavity of upper tibia bone in BCP and A groups,amiloride(A group)or normal saline(BCP group)were injected around upper tibia bone at d7 after the model induced．Rats in Sham group were injected with Hank solution into marrow cavity of upper tibia bone,and normal saline around upper tibia bone at the same time points．The mechanical withdrawal threshold(MWT)was measured at d1 before(T0)and d7 after injection(T1)of Walker-256 cells or Hank's solution;30 min(T2)and 1(T3),2(T4),4(T5)and 8h(T6)after injection of amiloride or normal saline．Results Compared to the baseline,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to control group,MWT was significantly decreased and the score of walk-associated ambulatory pain was increased in BCP and A group at all time points;compared to BCP group,MWT was significantly increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased at time points T2～T5in A group;compared with T1,MWT was increased and the score of walk-associated ambulatory pain was decreased in A group at time points T2～T5． Conclusion Regional injection of amiloride can reduce mechanical allodynia in a rat model of tibial bone cancer pain．