林小春 葉曉華 林瑞霞 楊青 陳敏廣

川芎嗪對IgA腎病大鼠模型足細(xì)胞的保護作用和作用機制

林小春 葉曉華 林瑞霞 楊青 陳敏廣

目的 研究川芎嗪對IgA腎病（IgAN）大鼠模型足細(xì)胞的保護作用和作用機制。 方法 建立IgAN大鼠模型，按照體重匹配原則分成正常組（A組）8只、模型組（B組）12只、地塞米松組（C組）12只、川芎嗪組（D組）12只。使用生化分析儀測定24h尿蛋白，電鏡觀察足細(xì)胞形態(tài)，RT-PCR檢測腎組織Nephrin mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果 B、C、D組在造模成功后第4周末均出現(xiàn)蛋白尿，第4、8、10、12周末時24h尿蛋白總量均高于A組，偶見肉眼血尿，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．01），但3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）；在第14、16周末時，C、D組24h尿蛋白總量明顯低于B組（P＜0．01）。電鏡下見A組足突形態(tài)正常,排列整齊，B組多數(shù)腎小球足突部分融合，C組和D組足突極少部分融合。RT-PCR檢測結(jié)果C、D組Nephrin mRNA表達(dá)水平較B組高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論 川芎嗪能降低IgAN大鼠的24h尿蛋白總量，減少足突的融合；Nephrin在IgAN大鼠模型損傷中起重要作用，川芎嗪能增加腎組織Nephrin mRNA的表達(dá)水平。

川芎嗪 IgA腎病 足細(xì)胞 Nephrin 大鼠

IgA腎?。↖gA nephropathy，IgAN）是我國最常見的原發(fā)性腎小球疾病，約占腎活檢病例的1/3，是一類臨床表現(xiàn)多樣，以腎小球系膜區(qū)IgA為主要免疫復(fù)合物顆粒樣沉積、系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)增多為特征的腎小球疾病?；颊咴谠\斷IgAN后10年內(nèi)（約20%）或20年內(nèi)（約36%）進入終末期腎功能衰竭[1-2]，然而目前仍無有效的治療方法。近年來發(fā)現(xiàn)IgAN與足細(xì)胞病變密切相關(guān)，其中Nephrin是足突特異性表達(dá)蛋白、維持腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的重要蛋白之一[3]。Gagliardini等[4]發(fā)現(xiàn)IgAN的足細(xì)胞的Nephrin、Podocin、Podoplaninm表達(dá)減少。川芎嗪（tetramethlpyrazine）是從川芎根莖中提取分離的生物堿單體，臨床發(fā)現(xiàn)其具有降低蛋白尿水平、減輕足細(xì)胞損傷的功能，是防治慢性腎功能衰竭、膜性腎病、紫癜性腎炎、狼瘡腎炎等腎臟疾病非常有前景的一種中藥[5-8]，因此，筆者將川芎嗪用于患有IgAN的大鼠模型，研究其對足細(xì)胞的保護作用和作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 選取44只清潔級SD雌性大鼠，體重154～170g，平均（163.000±4.503）g。經(jīng)尿常規(guī)檢查無異常后，按照配對（體重基本相同）比較法分成4組，正常組（A組）8只，體重155～170g，平均（162.630±5.344）g；模型組（B組）12只，體重154～170g，平均（163.000±4.553）g；地塞米松組（C組）12只，體重154～170g，平均（162.830± 4.345）g；川芎嗪組（D組）12只，體重154～170g，平均（163.420±4.602）g。主要試劑：牛血清白蛋白（Amresco公司，BSA），脂多糖（Sigma公司），四氯化碳（南京化工有限公司），F(xiàn)ITC標(biāo)記的小鼠抗大鼠IgA（Secrotec公司），注射用川芎嗪針（哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司），注射用地塞米松針（安徽豐原藥業(yè)有限公司）。

1.2 方法 模型的制作參照劉志紅、湯穎等[9-10]使用的方法。操作步驟：將所有大鼠于實驗第1天起隔日灌服BSA400mg/kg（0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為50mg/ml的溶液），持續(xù)8周；第6周起予BSA 20mg/kg（0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為25mg/ml的注射液）尾靜脈注射，1次/周，連續(xù)3周；第6、8周時在尾靜脈分別注射0.3mg/ kg脂多糖（0.9%氯化鈉溶液稀釋成濃度為0.25mg/ml的注射液）1次。第1周起皮下注射四氯化碳0.1ml，并與蓖麻油0.4ml混合，每周1次，持續(xù)10周，觀察至第12周末。A組以等量的0.9%氯化鈉溶液代替造模使用的藥物。給藥方法：第12周起C組予地塞米松針2.5mg/kg腹腔注射，1次/d，D組予川芎嗪針80mg/kg腹腔注射，1次/d，A、B組予等量0.9%氯化鈉溶液腹腔注射，1次/d，持續(xù)4周。

1.3 動物標(biāo)本的留取 各組實驗大鼠分別在造模后第4、8、10、12、14、16周末用代謝籠收集24h尿液；實驗結(jié)束后禁食12h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，沿腹中線剖開取腎臟，一塊腎組織保存于40g/L多聚甲醛液中，用于常規(guī)光鏡檢測；一塊腎組織立即用0.9%氯化鈉溶液紗布包裹，以免干涸，用于冰凍切片行免疫熒光檢測；一塊腎組織直接放入液氮中用于RT-PCR檢查；同時切取約1mm3腎皮質(zhì)以2.5%戊二醛加2%多聚甲醛混合液固定后用于電鏡檢查。

1.4 監(jiān)測指標(biāo) 采用全自動生化分析儀檢測第4、8、10、12、14、16周末24h尿蛋白總量，直接免疫熒光法測定IgA沉積強度；HE和PAS染色觀察腎組織病理改變；電鏡下觀察足細(xì)胞形態(tài)變化。RT-PCR檢測腎組織Nephrin mRNA的表達(dá)水平，采用GelPro31分析軟件計算Nephrin、GAPDH電泳條帶的光密度（IOD）值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，組間及組內(nèi)比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠24h尿蛋白總量的變化 見表1。

表1 4組大鼠24h尿蛋白總量的變化（mg）

由表1可見，實驗過程中，A組未出現(xiàn)大鼠死亡，B組死亡4只分別在第12、15、16周，C、D組死亡各2只，均在第12周。B、C、D組在造模成功后第4周末均出現(xiàn)蛋白尿，第4、8、10、12周末時24h尿蛋白總量均高于A組，偶見肉眼血尿，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），但3組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；在第14、16周末時，C、D組24h尿蛋白總量明顯低于B組（P＜0.01），與D組比較，C組對蛋白尿的改善作用明顯（P＜0.01）。2.2 4組腎組織免疫熒光IgA沉積 A組大鼠腎小球IgA沉積呈陰性反應(yīng)；B組大鼠腎組織均發(fā)現(xiàn)腎小球系膜區(qū)有較強的顆粒狀I(lǐng)gA沉積；C、D組有不同程度的IgA沉積，但沉積程度較B組輕，其中C組最輕，部分不能清晰顯示（圖1）。4組間熒光灰度值的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），詳見表2。

表2 4組大鼠IgA免疫熒光平均灰度值

圖1 4組大鼠IgA免疫熒光檢測比較（A：A組陰性；B：B組腎小球系膜區(qū)有較強的顆粒狀I(lǐng)gA沉積；C：C組沉積程度較B組輕；D：D組沉積程度較B組輕，但較C組明顯；×400）

2.3 4組腎組織的光鏡和電鏡觀察結(jié)果 光鏡：A組腎小球體積正常，系膜區(qū)細(xì)胞無明顯增生，系膜基質(zhì)未見增加，毛細(xì)血管袢開放良好；B組腎小球體積增大，系膜細(xì)胞和系膜基質(zhì)中度增生，系膜區(qū)明顯增寬，腎間質(zhì)可見淋巴細(xì)胞浸潤；C、D組大鼠腎小球體積均輕度增大，系膜細(xì)胞及基質(zhì)以輕度增生為主，D組有少許中度增生，系膜區(qū)增寬不明顯，少見新月體形成和硬化，腎間質(zhì)有少數(shù)淋巴細(xì)胞浸潤，其中C組改善更明顯。腎小球細(xì)胞計數(shù)：A組（44.13±3.16）個/腎小球，B組（65.31±4.61）個/腎小球，C組（47.43±5.50）個/腎小球，D組（55.42±6.74）個/腎小球，各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。電鏡：A組足突形態(tài)正常，排列整齊；B組多數(shù)腎小球足突部分融合；C組和D組足突極少部分融合，其中C組更為明顯，詳見圖2、3。

圖2 4組腎組織光鏡病理切片比較（A：A組結(jié)構(gòu)正常；B：B組系膜細(xì)胞及基質(zhì)中度增生；C：C組系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕度增生；D：D組系膜細(xì)胞及基質(zhì)輕-中度增生；HE染色，×400）

圖3 4組腎組織電鏡足細(xì)胞比較（A：A組足突形態(tài)正常；B：B組足突部分融合、脫落；C：C組足突極少部分有融合；D：D組足突少許部分融合；×15 000）

2.4 4組大鼠腎組織Nephrin mRNA表達(dá)情況 C、D組腎組織中的Nephrin mRNA表達(dá)水平較B組升高（P＜0.01），且C組表達(dá)水平比D組高（P＜O.01），詳見表3、圖4。

表3 4組大鼠腎組織Nephrin mRNA表達(dá)情況

3 討論

圖4 第16周末4組大鼠組織Nephrin mRNA的表達(dá)

IgAN臨床表現(xiàn)多樣、病理改變復(fù)雜，迄今尚未完全闡明其確切的發(fā)病機制，目前臨床上缺乏特異性的治療措施，因此對本病的相關(guān)研究具有積極的臨床意義。目前IgAN仍無有效的治療方案，糖皮質(zhì)激素是最重要、最常用的抗炎藥物，但糖皮質(zhì)激素在針對病理變化較重、糖皮質(zhì)激素抵抗或使用激素不良反應(yīng)明顯的IgAN患者的治療中仍存在盲點。因此，有必要為IgAN患者尋求一種新的有效藥物或者聯(lián)合治療，減少激素的不良反應(yīng)。

川芎嗪是從川芎根莖中提取分離的生物堿單體，臨床應(yīng)用已表明川芎嗪有降低蛋白尿水平，減少免疫復(fù)合物沉積，減輕足細(xì)胞損傷，是防治慢性腎功能衰竭、膜性腎病、紫癜性腎炎、狼瘡腎炎等腎臟疾病非常有前景的一種中藥。張明霞[11]關(guān)于川芎嗪治療原發(fā)性腎病患者（其中IgAN 3例）的研究表明，川芎嗪可減輕腎小球病理損傷，減少尿蛋白量，保護腎功能，但I(xiàn)gAN例數(shù)較少。有文獻(xiàn)表明，蛋白尿一方面能反映腎小球損傷，另一方面是導(dǎo)致慢性腎臟病變的獨立危險因素，臨床上備受關(guān)注[12]。這是由于大量蛋白尿會引起腎小球三高（高灌注、高濾過、高囊內(nèi)壓），最終導(dǎo)致腎小球硬化以及腎間質(zhì)的纖維化。本實驗動態(tài)觀察了各實驗組的蛋白尿情況，發(fā)現(xiàn)川芎嗪可以降低IgAN模型大鼠的蛋白尿。

足細(xì)胞與IgAN關(guān)系密切。Lemeley等[13]發(fā)現(xiàn)IgAN患者足細(xì)胞數(shù)目的缺失程度與其病情進展密切相關(guān)，它與臨床蛋白尿的增加、腎功能的下降及病理腎小球的硬化程度密切相關(guān)，提示足細(xì)胞缺失可能是IgAN病情加重的征兆。Hishikit等[14]則在IgAN患者腎組織光鏡和電鏡下觀察其病理變化，發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷是預(yù)測IgAN預(yù)后不良的高敏感指標(biāo)之一，其中Nephrin是足突特異性表達(dá)蛋白,是維持腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)和功能完整性的重要蛋白之一[3]。Nephrin為跨膜蛋白并在裂孔膜上特異表達(dá)，Podocin通過其C末端與Nephrin相互作用，可促進Nephrin誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。研究表明，Nephrin、Podocin信號傳導(dǎo)異常會引起足細(xì)胞功能異常并且導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[15]。本實驗發(fā)現(xiàn)IgAN腎組織足突部分的融合，Nephrin表達(dá)的減少，蛋白尿的增多，C、D組Nephrin的表達(dá)較B組表達(dá)明顯上升，足細(xì)胞融合較B組減少，可能為其治療IgAN的另一種機制。

本實驗雖然成功復(fù)制了IgAN的腎臟病理改變以及炎癥發(fā)生過程，但仍為一種繼發(fā)性的IgAN模型，腎組織新月體形成等纖維化、硬化表現(xiàn)少見，與臨床以低糖基化理論為核心的IgAN發(fā)病過程尚有一定的差別。此外，本研究在川芎嗪注射治療階段中無一例大鼠死亡，可見其不良反應(yīng)小，但未監(jiān)測相關(guān)指標(biāo)，尚需要完善。雖然川芎嗪具有降低蛋白尿、抑制炎癥反應(yīng)和改善足細(xì)胞融合等重要作用已在本研究中得到充分體現(xiàn)，但川芎嗪類藥物對IgAN的臨床治療意義還需要更多的實驗論證。

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Protective effects of tetramethylpyrazine on podocytes of rats with IgA nephropathy

Objective To investigate the effects of tetramethylpyrazine (TMP)on podocytes of rats with IgA nephropathy．Methods Female Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into 4 groups:control group(group A,n=8),IgA nephropathy model group(group B,n=12),dexamethasone(DXM)group（group C,n=12）and TMP group(group D,n=12)．IgA nephropathy was induced in groups B,C,D,DXM and TMP were given to groups C and D respectively．The 24h-urine protein was determined with a automatic biochemistry analyzer;the morphology of podocyte was observed with transmission electron microscope;and the expression of Nephrin mRNA was detected by RT-PCR．Results Proteinuria was presented in group B,C and D from week 4,the quantity of 24h urinary protein was all higher than that in group A(P＜0．01);but the quantity in group C and D was significantly lower than that in group B in week 14 and 16 (P＜0．01)．Electron microscopy showed that most glomerular foot processes were fused in group B,but only few in group C and D．The expression of Nephrin mRNA in renal tissue of group C and group D was significantly higher than that of group B(P＜0．01)．Conclusion Like dexamethasone,TMP can reduce 24h-urinary protein excretion and improve foot process fusion in rat IgA nephropathy,which is associate with up-regulation of Nephrin mRNA in renal tissue．

Tetramethlpyrazine IgA nephropathy Podocyte Nephrin Rat

2012-10-23）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金（2009CB056、2011ZA076）作者單位：325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院腎內(nèi)科

林瑞霞，E-mail:dd-byx@163.com