穆慶，許艷麗，陳鵬，王丹波

(中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽 110004)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是婦科常見病及難治病，其發(fā)病機制研究一直是婦科的臨床研究熱點之一。近年來，“在位內(nèi)膜決定論”受到關(guān)注，即內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜的基因異常是內(nèi)異癥發(fā)生的重要原因，但在位內(nèi)膜的特異性靶基因尚未揭曉。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cofilin-1基因(CFL1)是內(nèi)異癥在位內(nèi)膜差異表達(dá)基因之一［1］，并證明在位內(nèi)膜CFL1高表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、增殖及新血管生成，發(fā)生內(nèi)異癥［2-3］，但其作用機制尚待進(jìn)一步證明。血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)已被證實在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜的增殖中起重要作用，本研究將探討CFL1與PDGF在內(nèi)異癥中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 組織收集和細(xì)胞培養(yǎng)

選擇中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院高期別卵巢內(nèi)異癥行子宮全切術(shù)患者12例(37～49歲)，樣本采集經(jīng)中國醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)并獲得患者的知情同意。所有患者在術(shù)前6個月未接受GnRH類藥物、激素類藥物及抗炎藥物治療。根據(jù)既往月經(jīng)周期及組織學(xué)檢查確定為分泌期標(biāo)本。術(shù)中即時獲得在位子宮內(nèi)膜組織處理及ESC培養(yǎng)方法與既往相關(guān)研究［2］相同。經(jīng)單層培養(yǎng)的ESC在第3代起可以達(dá)到99%的純度，第3代細(xì)胞將用于后續(xù)試驗。

1．2 PDGF 實驗

單層培養(yǎng)的ESC在第2代鋪滿培養(yǎng)瓶底后傳代為第3代按6孔板每孔105個細(xì)胞數(shù)接種，培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液換成無血清的DMEM/F12孵育24 h。在12例 ESC 細(xì)胞中加入10 ng·ml－1PDGF(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)分別作用 3、6、12 h。另外，在12 例 ESC 細(xì)胞中分別加入 1.0、10、100 ng·ml－1的PDGF作用6 h，以PBS代替PDGF作為0濃度組。

1．3 實時熒光定量PCR

使用 Trizol試劑(TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)從來自于各組相同數(shù)量的細(xì)胞中提取RNA，按試劑盒說明書要求的標(biāo)準(zhǔn)無酶操作進(jìn)行。按SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒 (TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)的逆轉(zhuǎn)錄說明書要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。CFL1引物序列為:5'-TGCCTGAGTGAGGACAAG-3'(正義鏈)，5'-GACAAAGGTGGCGTAGGG-3'(反義鏈)。內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，引物序列為:5'-GCACCG TCAAGGCTGAGAAC-3'(正義鏈)，5'-ATGGTGGTGAA GACCCAGT-3'(反義鏈)。在 LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)上按照SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)的使用說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45 個循環(huán)。CFL1 mRNA 水平以2－△△CT［4］方法計算，同時為保證mRNA水平不受細(xì)胞數(shù)量影響，反轉(zhuǎn)錄按照20 μl體系進(jìn)行，總RNA定量為1 000 ng，并且所有標(biāo)本均同一批次反轉(zhuǎn)錄。

1．4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

鏡下觀察PDGF處理前后ESC形態(tài)學(xué)無明顯改變。10 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 0、3、6、12 h，ESC中CFL1 mRNA的水平隨著刺激時間的延長顯著上調(diào)，各組CFL1 mRNA表達(dá)相對水平分別為1.09±0.13、1.61±0.24、2.31±0.30和 3.61±0.60，與 0 h組比較，6 h和12 h組表達(dá)增高有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖1。

圖1 PDGF處理后ESC時間依賴性CFL1 mRNA表達(dá)Fig 1 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in a time-dependent manner

以1、10、100 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 6 h 與未進(jìn)行PDGF處理(PBS代替PDGF)的ESC比較，隨著處理劑量的增加CFL1 mRNA的水平也顯著上調(diào)，各組CFL1 mRNA表達(dá)相對水平分別為1.78±0.36、2.43±0.41和3.87±0.84，與未處理組(1.09±0.13)相比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見圖2。

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與異位內(nèi)膜細(xì)胞較強的黏附、增殖及新血管生成等生物學(xué)功能密切相關(guān)?！霸谖粌?nèi)膜決定論”是近年來子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生機制的熱點理論［5］，已證實內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、增殖及新血管生成的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)異常，其中PDGF是重要候選基因之一。PDGF是活化的巨噬細(xì)胞的特征性分泌產(chǎn)物，是成纖維細(xì)胞和血管形成前體細(xì)胞有效的促有絲分裂劑［6-7］。PDGF對多種腫瘤細(xì)胞增殖血管形成有重要作用［8-9］，同時內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖也呈現(xiàn)了明顯的劑量依賴性。此外，PDGF是內(nèi)異癥異位病變血管形成過程的關(guān)鍵部分［10］。因此，PDGF可能是與內(nèi)異癥發(fā)病機制相關(guān)的關(guān)鍵因素。

圖2 PDGF處理后ESC濃度依賴性CFL1 mRNA表達(dá)Fig 2 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in dose-depentdent manner

CFL1是普遍表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，屬于肌動蛋白解聚因子家族，在促進(jìn)肌動蛋白解聚/聚合過程和肌動蛋白片段的迅速轉(zhuǎn)換中具有重要角色［11］。肌動蛋白細(xì)胞骨架的重組對腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞動力、細(xì)胞黏附、細(xì)胞侵襲和血管形成均十分關(guān)鍵［12］。CFL1的基本功能與內(nèi)異癥的生物學(xué)特點高度一致，同時本研究組前期對內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)基因篩查發(fā)現(xiàn)，CFL1是在位內(nèi)膜上調(diào)候選基因之一［1］，經(jīng)過全面驗證，CFL1過度表達(dá)在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、增殖及血管生成中起重要作用［2-3］。因此，CFL1在內(nèi)異癥中的作用機制研究成為本課題組進(jìn)一步研究重點，而PDGF與CFL1的調(diào)控關(guān)系值得關(guān)注。本實驗結(jié)果顯示，ESC中CFL1 mRNA的表達(dá)隨著PDGF作用時間延長而增加，隨PDGF濃度增高而增加。因此，PDGF可能是CFL1表達(dá)的強誘導(dǎo)劑，PDGF對于內(nèi)異癥發(fā)生、發(fā)展的影響可能與CFL1相關(guān)。肌動蛋白動力學(xué)與細(xì)胞增殖直接相關(guān)［13］，并且增殖起源于肌動蛋白的重組［14］，CFL1 正是肌動蛋白解聚因子家族成員，因此CFL1直接促進(jìn)細(xì)胞的增殖。研究顯示，PDGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖與RhoA-ROCK信號途徑相關(guān)［15］。CFL1是RhoA-ROCK信號途徑的下游信號分子。可以推測，PDGF對于內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖調(diào)控可能通過RhoA-ROCK信號途徑對CFL1的調(diào)控實現(xiàn)。CFL1表達(dá)的改變可能對PDGF誘導(dǎo)的ESC增殖十分必要，具體機制有待進(jìn)一步研究。Hu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PDGF激活PI3K通路可促進(jìn)肌動蛋白重組，定向細(xì)胞運動，刺激細(xì)胞生長，并抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，豬腎小管上皮細(xì)胞［17］中PI3K通路的激活可以使SSH1活化，進(jìn)一步通過使CFL1去磷酸化而具有活性。因此，進(jìn)一步研究子宮內(nèi)異癥患者PDGF調(diào)控CFL1的具體信號通路，有助于通過阻斷某一通路，達(dá)到靶基因治療內(nèi)異癥的目的。

總之，本實驗結(jié)果提示，在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，PDGF可能是CFL1基因表達(dá)的強誘導(dǎo)劑，而且與作用時間、濃度均有關(guān)系，但具體通路有待進(jìn)一步驗證。

［1］CHEN Q，ZHANG C Y，CHEN Y H，et al．Identification of endometriosis-related genes by representational difference analysis of c DNA ［J］．Aust N Z J Obstet Gynaecol，2012，52(2):140-145．

［2］XU Y L，WANG D B，LIU Q F，et al．Silencing of cofilin-1 gene attenuates biological behaviors of stromal cells in eutopic endometriawith endometriosis［J］．Human Reproduction，2010，25(10):2480-2488．

［3］許艷麗，王丹波．子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜中cofilin-1蛋白表達(dá)水平與其種植能力的關(guān)系［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2010，45(4):252-255．

［4］BURGER H，F(xiàn)OEKENS J A，LOOK M P，et al．RNA expression of breast cancer resistan ce protein，lung resistan ce-related protein，multidrug resistan ce-associated proteins 1 and 2，and multidrug resistan ce gene 1 in breast cancer:correlation with chemotherapeutic response［J］．Clin Cancer Res，2003，9(2):827-836．

［5］郎景和．子宮內(nèi)膜異位癥研究的新里程［J］．中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40(1):3-4．

［6］ROSS R，RAINES E W，BOWEN-POPE D F．The biology of platelet-derived growth factor［J］．Cell，1986，46:155．

［7］徐惠，官陽，楊木蘭，等．PDGF及PDGFR在大鼠腎間質(zhì)纖維化過程中的作用［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，17(19):2354-2358．

［8］李俊生，湯文浩．PDGF受體酪氨酸激酶抑制劑在胰腺癌中是否有作用?［J］．東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2006，25(2):77-82．

［9］沈令廣，黃慶功，李儉銀，等．血小板源性生長因子B在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系［J］．中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2011，21(16):1841-1844．

［10］LASCHKE M W，ELITZSCH A，VOLLMAR B，et al．Combined inhibition ofvascular endothelialgrowth factor(VEGF)，fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor，but not inhibition of VEGF alone，effectively suppresses angiogenesis and vessel maturation in endometriotic lesions［J］．Human Reproduction，2006，21(1):262-268．

［11］CHEN H，BERNSTEIN B W，BAMBURG J R．Regulating actin-filament dynamics in vivo［J］．Trends Biochem Sci，2000，25(1):19-23．

［12］HOTULAINEN P，PAUNOLA E，VARTIAINEN M K，et al．Actin-depolymerizing factor and cofilin-1 play overlapping roles in promoting rapid F-actin depolymerization in ma mmalian no nmuscle cells［J］．Mol Biol Cell，2005，16(2):649-664．

［13］dos REMEDIOS C G，CHHABRA D，KEKIC M，et al．Actin binding proteins:Regulation of cytoskeletal microfilaments［J］．Physiol Rev，2003，83(2):433-473．

［14］SUBRAMANIAM V，INCENT I R，OTHY S．Upregulation and ephosphorylation of cofilin:modulation by CD44 variant soform in human colon cancer cells ［J］．Exp Mol Pathol，2005，79(3):187-193．

［15］ZOHRABIAN V M，F(xiàn)ORZANI B，CHAU Z，et al．Rho/ROCK and MAPK Signaling Pathways Are Involved in Glioblastoma Cell Migration and Proliferation［J］．Anticancer Res，2009，29(1):119-124．

［16］HU Q，KLIPPEL A，MUSLIN A J，et al．Ras-dependent induction of cellular responses by constitutively active phosphatidylinositol-3 kinase［J］．Science，1995，268(5207):100-102．

［17］ ISHIBASHI F．High glucos e increases phosphocofilin via phosphorylation of LIM kinase due to Rho/Rho kinase activation in cultured pig proximal tubular epithelial cells［J］．Diabetes Res Clin Pract，2008，80(1):24-33．