陸樹洋(綜述) 孫曉寧 王春生(審校)

(上海市心血管病研究所-復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院心臟外科 上海 200032)

冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)(coronary artery bypass grafting，CABG)是目前外科治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的主要方法之一，其中5% ～30%患者需要兩次、甚至兩次以上的CABG或存在周圍血管病變，缺乏合適的自身血管逐漸成為治療此類疾病的最大問題［1］。因此，小口徑人造血管(≤4 mm)［2］作為替代物的研究與開發(fā)成為國(guó)內(nèi)外近十年來的熱點(diǎn)。然而，目前所有小口徑人工血管材料都存在一個(gè)致命的共同問題:血液相容性差。當(dāng)其移植入體內(nèi)后，容易導(dǎo)致血栓形成，遠(yuǎn)期還易出現(xiàn)內(nèi)膜增生［1，3－4］。如果將直徑≤4 mm 的小口徑人工血管植到冠狀動(dòng)脈或外周小血管，血管堵塞率很高。要解決這些問題的關(guān)鍵是促使人工血管的表面盡快內(nèi)皮化，形成具有功能的完整的內(nèi)皮層可以有效抑制血管狹窄及堵塞的發(fā)生［1］。本文旨在對(duì)小口徑人工血管及其內(nèi)皮化的策略研究進(jìn)展作一綜述。

小口徑人工血管的材料選擇

聚四氟乙烯(Teflon，expanded polytetrafluor-oethylene，ePTFE) ePTFE是一種化學(xué)穩(wěn)定性極佳的新型高分子材料，其由兩層材料組成:內(nèi)層材料呈縱向性 ，外層材料呈橫向性 ，從而結(jié)合成為一種縱向、橫向都極度牢固的血管壁結(jié)構(gòu)。其管壁具有無數(shù)的微孔結(jié)構(gòu)可以提高材料的順應(yīng)性，植入人體后，組織可迅速貼敷到血管外壁上，成纖維細(xì)胞和結(jié)締組織在管壁微孔中廣泛長(zhǎng)入，從而較易在內(nèi)壁形成完整而較薄的新內(nèi)膜。ePTFE具有較高的負(fù)電性，膜薄、光滑，發(fā)生腔內(nèi)凝血幾率相對(duì)小，與人體組織相容性較好，同時(shí)其柔順性強(qiáng)，易縫合，對(duì)人體無任何不良反應(yīng)，可作為體內(nèi)保持持久強(qiáng)度的血管代用品。ePTFE人工血管管壁沒有縱向延展性，血管壁易生成假性動(dòng)脈瘤，且植覆內(nèi)皮細(xì)胞也有困難。此外，有機(jī)溶劑也可增加ePTFE人工血管移植物的多孔性和過濾性，容易形成移植物周圍血清腫。

滌綸，即聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯(Dacron，polyethylene terephthalate，PET) 人工血管的材料起初是用奧綸、尼龍織成，后因在生物體內(nèi)植入后結(jié)果均不理想而被淘汰?，F(xiàn)在多采用PET纖維編織人工血管，已大量應(yīng)用于臨床。臨床上使用的PET血管的編織方法主要有機(jī)織和針織兩種方式。機(jī)織的人工血管是指多股PET絲線按經(jīng)緯方向通過上下交叉編織，具有這種結(jié)構(gòu)的人工血管孔隙率小、空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。因此，機(jī)織人工血管具有較低的出血率和較低的植入后結(jié)構(gòu)變形幾率，其缺點(diǎn)是可改變的機(jī)械性能不足，順應(yīng)性差，修剪邊緣易破損，與組織結(jié)合不牢固。針織人工血管是指通過PET絲線環(huán)扣成聯(lián)鎖結(jié)的編織方法進(jìn)行制備。按周徑編織的人工血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較差，所以絕大多數(shù)針織人工血管是通過沿經(jīng)線方向進(jìn)行編織的。Koper針織方法是用絲線在人工血管內(nèi)表面按垂直正交的方法來編織以增加人工血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的。另外，利用編絲絨的方法在織物表面延長(zhǎng)絲線圈的長(zhǎng)度從而增加人工血管與組織的結(jié)合，人工血管外側(cè)面的絨毛狀絲線能保證人工血管跟周圍組織的結(jié)合，但是內(nèi)側(cè)面的絨毛結(jié)構(gòu)會(huì)增加纖維蛋白和血小板的固定。針織人工血管不足之處在于管壁皺折，有高度的多孔性，網(wǎng)孔較大，移植時(shí)滲血現(xiàn)象嚴(yán)重，使用前必須預(yù)凝。此外，與ePTFE相比，PET與周圍組織反應(yīng)較強(qiáng)，易激活血小板，抗血栓形成性較低，生物相容性也較差，炎性反應(yīng)重。

聚氨酯(polyurethane，PU) PU是一種具有良好的理化性能、血液相容性和生物相容性的醫(yī)用高分子材料。其具有良好的順應(yīng)性、韌性和彈性，耐磨、耐腐蝕，易加工，能采用通常的方法滅菌，還具有抗凝血功能，無致畸變作用，無過敏反應(yīng)?？筛鶕?jù)設(shè)計(jì)的要求，通過分子結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)調(diào)整其物理化學(xué)性質(zhì)。由于其具有優(yōu)秀的機(jī)械性能，因此可通過加工技術(shù)控制孔隙度，調(diào)整達(dá)到與天然血管順應(yīng)性的匹配。然而，目前尚沒有足夠的證據(jù)說明PU人工血管優(yōu)于ePTFE和PET人工血管，而且，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示PU降解后產(chǎn)物2，4-甲基苯二胺具有致癌作用。

促進(jìn)內(nèi)皮化的途徑 目前，促進(jìn)組織工程血管內(nèi)皮化的主要途徑有兩種:一是內(nèi)皮細(xì)胞體外種植法，包括單期種植法、二期種植法以及自體靜脈碎片快速種植法，二是內(nèi)皮細(xì)胞體內(nèi)原位表面化。

單期種植法:將用機(jī)械法或酶解法獲取的新鮮內(nèi)皮細(xì)胞在手術(shù)前較短的時(shí)間內(nèi)種植于人工血管的管壁，然后直接用于手術(shù)。此種方法簡(jiǎn)便易行，然而直接獲取的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量有限，并且種植的內(nèi)皮細(xì)胞抗血流切應(yīng)力差，難以確保種植后形成完整的內(nèi)膜。二期種植法:將獲取的內(nèi)皮細(xì)胞先行離體培養(yǎng)，再高密度種植于人工血管表面。二期種植法較單期種植法可以獲取足夠的細(xì)胞數(shù)量，但是，體外內(nèi)皮細(xì)胞種植法需要耗費(fèi)大量的財(cái)力以及時(shí)間，需要具備一定的實(shí)驗(yàn)室硬件，同時(shí)，操作者需要具備嫻熟的內(nèi)皮細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞的體外分離及擴(kuò)增的能力。

內(nèi)皮細(xì)胞體內(nèi)表面內(nèi)皮化主要有以下理論:(1)宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞從吻合口向人工血管的遷移，但是內(nèi)皮化僅限于吻合口周圍2 cm。(2)周圍組織毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞通過人工血管壁的長(zhǎng)入。周圍組織的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞可以從多孔人工血管壁長(zhǎng)入而形成人工血管內(nèi)膜?？讖綖?0 μm左右的多孔人工血管材料較為理想。(3)循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞在人工血管內(nèi)表面的沉積。由于體外種植法的種種弊端，利用自體內(nèi)皮細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)移植物在體內(nèi)表面內(nèi)皮化成為近年來研究的熱點(diǎn)。

促進(jìn)內(nèi)皮化細(xì)胞的選擇 組織工程血管內(nèi)皮化細(xì)胞來源包括成熟的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及多能干細(xì)胞。諸多研究認(rèn)為內(nèi)皮祖細(xì)胞可能是內(nèi)皮化細(xì)胞的良好選擇。內(nèi)皮祖細(xì)胞是一類未分化的成體干細(xì)胞，具有增殖和分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的潛能，它和胚胎源性成血管細(xì)胞具有相似的性狀，主要來源于骨髓。健康個(gè)體外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞的水平非常低，但粒細(xì)胞集落刺激因子或血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子可動(dòng)員骨髓中內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放到外周血中。成熟內(nèi)皮細(xì)胞屬于終末分化細(xì)胞，分裂增生修復(fù)損傷內(nèi)皮的潛能很低，而內(nèi)皮祖細(xì)胞修復(fù)能力很強(qiáng)，同時(shí)可以促進(jìn)新生血管形成。大量體外及體內(nèi)研究表明［5－6］，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以通過促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化以及誘導(dǎo)缺血缺氧區(qū)的新生血管形成改善缺血器官的功能。一些研究者通過全身系統(tǒng)應(yīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞，促進(jìn)其歸巢到受損血管，可以有效促進(jìn)其內(nèi)皮化［7］。早期的一些研究同樣表明［8－9］，在人工血管表面體外種植外周血來源或骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞可以在人工血管表面形成具有抗血栓性質(zhì)的內(nèi)皮界面。

促進(jìn)小口徑移植血管在體內(nèi)皮化的策略

接枝抗循環(huán)EC/EPC膜受體的抗體 在人造血管表面形成光滑的內(nèi)皮層是提高人工血管血液相容性、改善遠(yuǎn)期通暢率的最好途徑。已有實(shí)驗(yàn)表明將體外種植CD34陽性細(xì)胞的人工血管移植至動(dòng)物體內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化，減少血栓形成幾率，提高血管的通暢率。然而，體外種植法的種種弊端使其難以普及。近年的研究發(fā)現(xiàn)人體外周血液循環(huán)中存在多潛能內(nèi)皮祖細(xì)胞，可定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞，具有再生功能，在受損部位可加速血管內(nèi)皮化［10］。設(shè)計(jì)針對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞表面分子標(biāo)簽 CD34/CD133/VEGF-1、2的抗體，接枝到移植物的表面來捕捉循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，較短時(shí)間內(nèi)可實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化。Rotmans等［11］研究可捕獲CD34抗原陽性的內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能性人工血管，雖然植入豬體內(nèi)后人工血管可以很快內(nèi)皮化，但內(nèi)膜仍然增生顯著，未能有效控制再狹窄。失敗原因在于研究應(yīng)用的CD34內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲存在著局限性，所捕獲的CD34抗原陽性內(nèi)皮祖細(xì)胞存在以下特點(diǎn):(1)抗原的特異性低，CD34抗原不是只表達(dá)在相對(duì)成熟的內(nèi)皮祖細(xì)胞上，也表達(dá)在成熟脫落的內(nèi)皮細(xì)胞上;(2)CD34+細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞等，因此，CD34+抗體捕獲的細(xì)胞仍有向血管平滑肌細(xì)胞分化的潛力，且捕獲的EPC分泌細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF和HGF)，對(duì)EPC和血管平滑肌細(xì)胞都有擴(kuò)增的作用，可導(dǎo)致內(nèi)膜過度增生。研究發(fā)現(xiàn)［12－13］，CD133抗原陽性內(nèi)皮祖細(xì)胞可以從外周血的單個(gè)核細(xì)胞分離，并在支持內(nèi)皮分化的培養(yǎng)基中長(zhǎng)期培養(yǎng)，內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)于剪切應(yīng)力易于形成管狀結(jié)構(gòu)。CD133是一個(gè)高度保守的抗原，它只表達(dá)于未成熟的內(nèi)皮祖細(xì)胞，在成熟的內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞上不表達(dá)。外周血中內(nèi)皮祖細(xì)胞廣泛存在，且?guī)в蠧D133抗原的內(nèi)皮祖細(xì)胞具有更好的分化潛能、表達(dá)及分化特異的特點(diǎn)，因此，捕獲CD133抗原陽性的內(nèi)皮祖細(xì)胞支架可能會(huì)有更好的效果，目前國(guó)際上尚無此類研究報(bào)道。

接枝EC/EPC整合素特異性識(shí)別的功能性短肽整合素是細(xì)胞膜調(diào)控細(xì)胞黏附到材料表面最主要的蛋白，它有兩種跨膜糖蛋白亞單位構(gòu)成，α鏈和β鏈，它們以非共價(jià)鍵形式結(jié)合在一起。在膜外部分的α鏈和β鏈相互作用，形成功能化的異二聚體。整合素通過膜外部分結(jié)構(gòu)與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用，通過細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)與細(xì)胞骨架和信號(hào)分子發(fā)生作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、鋪展、生長(zhǎng)和分化。

RGD序列是組織工程領(lǐng)域最常用的功能性短肽，把其固定到人工材料的表面可以促進(jìn)細(xì)胞的黏附，它存在于許多細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，如纖粘連蛋白、波形蛋白以及膠原等。具有特定空間構(gòu)象的短肽序列RGD作為配體與整合素特異性的結(jié)合而介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)材料的黏附、遷移和增殖。Blindt等［14］研究發(fā)現(xiàn)把環(huán)狀RGD(cRGD)包被到支架表面，體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)其可以有效招募內(nèi)皮祖細(xì)胞，抑制冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增生。此外，REDV以及SVVYGLR功能性短肽序列也可以被整合素識(shí)別，介導(dǎo)細(xì)胞的黏附增殖以及遷移。

包被磁性分子 通過使用磁力促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞滯留是促進(jìn)內(nèi)皮化的另外一種方法。Consigny等［15］首次提出通過外界磁場(chǎng)使得鐵負(fù)荷的細(xì)胞在組織局部滯留的概念。然而，細(xì)胞黏附主要出現(xiàn)在磁場(chǎng)附近，需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化。Pislaru等［16］研究通過使PET人工血管進(jìn)行磁性處理，促進(jìn)超順磁性標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞黏附，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞黏附能力有顯著差異。隨后使用流動(dòng)小室對(duì)黏附的細(xì)胞進(jìn)行剪切力實(shí)驗(yàn)，流速在300 mL/min的情況下，有70%的細(xì)胞可以滯留，流速達(dá)到400 mL/min時(shí)仍有61%的細(xì)胞可以滯留。豬頸動(dòng)脈血管移植模型進(jìn)一步證實(shí)了磁力可以實(shí)現(xiàn)快速內(nèi)皮化。Pislaru等［17］把這一技術(shù)理論運(yùn)用到支架上，同樣證實(shí)了磁性處理后的支架可以有效促進(jìn)超順磁性標(biāo)記的內(nèi)皮組細(xì)胞，是對(duì)照組的6～30倍。

與上述使用cRGD功能性短肽以及CD34抗體捕捉內(nèi)皮祖細(xì)胞不同的是，通過磁力捕捉內(nèi)皮祖細(xì)胞首先需要分離和磁性標(biāo)記內(nèi)皮祖細(xì)胞。然而，內(nèi)皮祖細(xì)胞體外的分離培養(yǎng)需要時(shí)間較長(zhǎng)，而且超順磁性微球標(biāo)記費(fèi)用昂貴，該種方法很難運(yùn)用于急診患者。此外，鐵負(fù)荷的內(nèi)皮祖細(xì)胞遠(yuǎn)期作用以及他們能否有效促進(jìn)內(nèi)皮化尚不清楚。超順磁性或鐵標(biāo)記的內(nèi)皮祖細(xì)胞釋放鐵微球顆?？梢约ぐl(fā)局部炎性反應(yīng)，而且其不可生物降解。Pislaru等［17］使用鎳材料包被支架，在一些個(gè)體上還出現(xiàn)了過敏反應(yīng)。因此，進(jìn)一步研究生物相容性的細(xì)胞標(biāo)記顆粒以及磁性材料是該技術(shù)遠(yuǎn)期研究的關(guān)鍵步驟。

包被特異性結(jié)合EC/EPC的適體 適體(aptamers)來源于拉丁文，意思就是適合，它是單鏈核酸，通常由70～80個(gè)核苷酸構(gòu)成，對(duì)于許多靶分子具有高度的親和力和特異性，如肽、蛋白質(zhì)、藥物、有機(jī)或無機(jī)分子，甚至是整個(gè)細(xì)胞［18－22］。能與靶分子識(shí)別的基礎(chǔ)是單鏈寡核苷酸所形成的復(fù)雜的空間三維結(jié)構(gòu)。1990年首次報(bào)道［23－24］適體的產(chǎn)生通常需要在體外與配體相互作用進(jìn)行選擇和擴(kuò)增的過程，稱為通過指數(shù)濃縮向心配體的系統(tǒng)演變(SELEX)。這種方法通過使用一對(duì)引物序列從多達(dá)1 015種不同核苷酸序列庫(kù)中化學(xué)合成出可以和靶分子高親和力結(jié)合的核酸配體。分離出來的適體和靶分子具有高度的親和力，他們的離解常數(shù)從納米級(jí)到皮克級(jí)，不遜于甚至優(yōu)于單克隆抗體。與抗體相比，適體在診斷分析方面有下面一些優(yōu)勢(shì):首先，適體是通過體外過程制備，不需要依賴動(dòng)物或者細(xì)胞等在體環(huán)境。正因?yàn)檫@些，可以為一些具有毒性的以及無免疫原性的靶分子制備適體。適體的生物利用度以及藥代動(dòng)力學(xué)可以通過化學(xué)修飾來保護(hù)適體在生物環(huán)境中不失活，比如通過化學(xué)修飾使適體可以抵抗核酸酶的消化。再者，適體易于長(zhǎng)期存放，同時(shí)變性有可逆性。一旦失去活性也可以在數(shù)分鐘內(nèi)恢復(fù)本來的構(gòu)象。

Hoffmann等［25］使用SELEX技術(shù)合成了對(duì)循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞具有高度親和力的適體。因?yàn)槿狈ωi內(nèi)皮祖細(xì)胞表面分子標(biāo)簽(CD133，CD34和VEGFR-2的單克隆抗體)，他們使用鼠抗豬CD31抗體包被磁珠來分離CD31陽性細(xì)胞。CD31分子廣泛表達(dá)在白細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞以及循環(huán)中內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面。通過運(yùn)用SELEX技術(shù)，他們合成單鏈DNA適體針對(duì)豬CD31陽性細(xì)胞亞群，通過流式細(xì)胞儀挑選出72%的CD31陽性細(xì)胞。這些適體需要共價(jià)結(jié)合到高分子聚合材料上，進(jìn)一步評(píng)估它們?cè)诹黧w狀態(tài)下的性能。把適體包被到人工材料表面可以特異性捕捉內(nèi)皮祖細(xì)胞，使得材料抗炎、抗栓能力增強(qiáng)，使其在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)內(nèi)皮化。把對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞有高親和力的適體以及無意義的適體分別包被到材料表面，通過豬在體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組適體可以豬血液循環(huán)中捕捉CD31以及CD144陽性細(xì)胞，而對(duì)照組材料表面沒有此類細(xì)胞貼覆。經(jīng)過培養(yǎng)10天，這些細(xì)胞表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特性。該研究表明適體在流體環(huán)境下可以捕捉循環(huán)中的內(nèi)皮祖細(xì)胞。目前，還有在體實(shí)驗(yàn)研究適體在捕捉內(nèi)皮祖細(xì)胞促進(jìn)心梗后心肌修復(fù)過程的優(yōu)勢(shì)。這種新型的分子技術(shù)對(duì)促進(jìn)植入體內(nèi)材料的內(nèi)皮化有著非常有益的作用。通過有效的捕捉內(nèi)皮祖細(xì)胞可以縮短內(nèi)皮化的時(shí)間，提高臨床醫(yī)用材料的應(yīng)用，同時(shí)也豐富了組織工程技術(shù)。

人工血管的基因修飾 人工血管的基因修飾是利用基因工程技術(shù)，將目的基因轉(zhuǎn)入到人工血管內(nèi)皮化的內(nèi)皮細(xì)胞中，增強(qiáng)其分泌細(xì)胞因子的能力，促進(jìn)其黏附生長(zhǎng)以及抗血栓功能。目前，已有多種基因，如beta半乳糖基因、組織型纖溶蛋白原基因、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因和血栓調(diào)節(jié)蛋白基因等用于內(nèi)皮細(xì)胞基因修飾研究，體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)研究也初步顯示了這一技術(shù)的良好前景。然而，在取得一定進(jìn)展的同時(shí)，也存在一些需要解決的問題:基因修飾后使得內(nèi)皮細(xì)胞在獲得新功能的同時(shí)，其黏附性及增殖功能也受到影響。

結(jié)語 小口徑人工血管移植后遠(yuǎn)期通暢率的問題仍然是目前亟待解決的首要問題。盡管目前促進(jìn)內(nèi)皮化的方法有很多，但每種方法都有其缺陷，沒有一種能從根本上解決遠(yuǎn)期通暢率問題。理想的人工血管植入體內(nèi)需要具有良好的力學(xué)性質(zhì)，同時(shí)還能發(fā)揮一定的正常血管的生理功能。單純從內(nèi)皮化的角度可能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，還要從人工血管材料以及基因修飾等多種手段，綜合提高小口徑血管臨床應(yīng)用所面臨的問題。

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