劉變枝朱曉鳴雷 武韓 冬楊云霞金俊琰解綬啟

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 牧醫(yī)工程學(xué)院, 鄭州 450002)

鹵蟲投喂下長吻?仔稚魚消化酶發(fā)育和口寬變化的研究

劉變枝1,2朱曉鳴1雷 武1韓 冬1楊云霞1金俊琰1解綬啟1

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué), 牧醫(yī)工程學(xué)院, 鄭州 450002)

采用酶學(xué)和形態(tài)學(xué)測定方法, 研究在投喂鹵蟲條件下長吻?仔魚4種主要消化酶: 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性變化以及長吻?仔魚口寬、全長變化。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行13d, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: (1)長吻?仔魚全長、口寬的發(fā)育與其日齡表現(xiàn)出明顯的線性正相關(guān)(R2TL= 0.974, R2MW= 0.964)?？趯捙c全長比值(MW/TL)在仔魚開口后急劇下降, 并自7日齡開始維持在0.07—0.08, 口寬和全長處于同步發(fā)育期并表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性(R2 = 0.948), 說明7日齡(/h, days post hatching)后口寬和全長處于同步發(fā)育期, 標(biāo)志仔魚轉(zhuǎn)食的開始。(2)長吻?仔魚初次開口時(shí)即可檢測出四種消化酶的活性。5—7/h時(shí)胰蛋白酶顯著高于初孵仔魚, 與此時(shí)仔魚開始開口攝食的行為相一致。胃蛋白酶、脂肪酶活性在仔魚孵化后第7天即開口的第3天, 淀粉酶活性在孵化后第6天, 顯著高于初次孵化出來的仔魚。8—13/h時(shí), 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性均在較高水平平穩(wěn)的波動(dòng), 標(biāo)志著消化道發(fā)育逐漸健全。

長吻?; 消化酶; 仔魚; 口寬; 全長

長吻?(Leiocassis longirostris Günther)俗稱江團(tuán)、肥坨、?魚, 主要分布于長江及遼河流域, 是長江干流的一種名貴肉食性經(jīng)濟(jì)魚類。近年, 過度捕撈和環(huán)境條件的惡化導(dǎo)致長吻?野生資源急劇銳減,人工養(yǎng)殖逐漸開展并開始走向規(guī)?；? 對(duì)長吻?苗種的需求劇增。但是在長吻?苗種生產(chǎn)中, 依靠傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)確定轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī)和專屬轉(zhuǎn)食飼料的缺失造成長吻?仔魚期大量死亡, 成為其規(guī)?；B(yǎng)殖的主要瓶頸, 也是很多種魚類苗種培育中所遇到的問題[1]。因此, 長吻?苗種培育期轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī)的選擇以及專屬轉(zhuǎn)食飼料的開發(fā)成為長吻?苗種培育中急需解決的問題。

仔魚只有在具有足夠的消化和吸收外源性餌料的能力后, 外源性餌料的引入才能夠使他們存活和生長。不合適的轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī)和轉(zhuǎn)食飼料往往造成仔魚的大量死亡[2,3]。仔魚人工配合飼料的組成、引入的時(shí)間要以仔魚發(fā)育過程中的消化生理狀況以及消化系統(tǒng)的完善程度為基準(zhǔn)[4—7]。因此, 了解仔稚魚何時(shí)具有攝食和消化外源性營養(yǎng)物質(zhì)的能力是我們進(jìn)行規(guī)模化苗種育種的首要前提。目前, 在長吻?苗種培育中, 長吻?幼魚體重、水溫、投喂水平對(duì)其生長的影響本實(shí)驗(yàn)室已有所研究[8,9]。本實(shí)驗(yàn)以剛出膜的長吻?仔稚魚為材料, 研究長吻?仔稚魚的消化酶活性變化趨勢以及口寬全長發(fā)育, 為提高長吻?仔稚魚期的生長、存活, 確定長吻?仔稚魚期合適的轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī), 研制合適的人工配合餌料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚、餌料及其養(yǎng)殖條件

實(shí)驗(yàn)用仔魚取自湖北省石首市國家級(jí)長吻?良種場, 仔魚于2006年5月2號(hào)晚21:00點(diǎn)開始脫膜,水溫26℃, 于5月3號(hào)上午10: 00脫膜結(jié)束(數(shù)據(jù)來源于石首市國家級(jí)長吻?良種場)。仔魚于5月6號(hào)(4dph)下午1: 30分運(yùn)回, 下午3: 00隨機(jī)分缸完畢,共10缸, 每缸330尾。

實(shí)驗(yàn)在室內(nèi)循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行。該系統(tǒng)由10個(gè)底部為圓錐形的玻璃纖維缸組成。內(nèi)設(shè)充氣石和進(jìn)水口, 進(jìn)行充氣和水流的交換。每個(gè)缸內(nèi)放置一長26.7 cm、寬24.6 cm、高20.4 cm的白色有機(jī)塑料箱,箱子四周打孔并貼有絹篩, 用于水流交換, 防止仔魚逃逸。每個(gè)箱子水容積約為12.5 L, 仔魚放置其中。

實(shí)驗(yàn)期間水溫控制在24—25℃, 光照周期為13h光亮和11h黑暗, 光亮周期從早7: 30持續(xù)到晚8: 30, 溶氧≥6 mg/L。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行13d。

實(shí)驗(yàn)期間, 每天早8: 00至晚8: 00每4h飽食投喂新鮮孵化的鹵蟲(天津紅太陽水產(chǎn)品有限公司, 粗蛋白58%, 粗脂肪19%)。投餌后1h, 虹吸管吸去剩余的鹵蟲、未孵化的蟲卵粒和死去的仔魚。

1.2 取樣方法

每天早 7:30 取樣5尾用于形態(tài)學(xué)測定, 游標(biāo)卡尺測定全長, 顯微鏡目測微尺測定口寬。仔魚剛出膜后取樣一次用于消化酶測定, 自孵化后5dph開始, 每天早7:30—8: 00(即距上次投喂11—12h取樣)間取樣一次, 取樣量據(jù)魚體增重情況每天做出調(diào)整,從最初的120 尾到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)40尾。日齡大于14dph的仔魚于腹部肛門處剪去尾部。取樣后, 用濾紙吸干魚體身上的水分后分裝入3個(gè)冷凍管, 立即放入液氮罐中速凍, 然后保存在?80℃冰箱中待測。所有樣品在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后半個(gè)月內(nèi)測定完畢。實(shí)驗(yàn)期間, 為消除外源性酶原帶來的影響, 取樣均在投喂前進(jìn)行。

1.3 樣品分析

由于實(shí)驗(yàn)魚規(guī)格的限制, 消化酶活性采用全魚勻漿測定。樣品解凍后, 按照1∶4 (w/v)的比例加入預(yù)冷勻漿介質(zhì)。0℃下用玻璃勻漿器勻漿, 冰凍離心(4000 r/min, 10min), 取上清液, 分光光度計(jì)比色測定酶活。胰蛋白酶活性的測定采用N-苯甲?；?L-精氨酸乙酯鹽酸鹽為底物測定[10]; 淀粉酶以淀粉為底物測定[11]; 脂肪酶的測定采用南京建成生物有限公司的試劑盒測定; 胃蛋白酶測定是在pH 2.0 的環(huán)境中以小牛血紅蛋白為底物測定[12]。蛋白總量根據(jù)Bradford[13]方法以小牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Statistica 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)分析前進(jìn)行齊性檢驗(yàn)(Homogeneity test of variances, Levene’s test), 然后做一元方差分析(Oneway ANOVA), 差異顯著則進(jìn)行多重比較 (Duncan’s multiple range tests), 顯著性水平為 P<0.05。結(jié)果表述為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)長吻?仔魚在5dph時(shí)就對(duì)鹵蟲有一個(gè)積極的攝食行為, 仔魚可以攝食新鮮孵化的鹵蟲。這和長吻?仔魚口寬的測定數(shù)據(jù)相一致。初次開口時(shí)仔魚的口寬為 (895±83) μm, 而剛孵化出的鹵蟲無節(jié)幼體體長一般為400—500 μm。

2.1 全長和口寬

長吻?仔魚自出膜到實(shí)驗(yàn)結(jié)束, 全長、口寬的發(fā)育與其日齡表現(xiàn)出明顯的線性正相關(guān)(R2TL= 0.974, R2MW= 0.964, 圖1; P<0.05)。

口寬與全長比值(MW/TL)在初次開口時(shí)較高,開口后比值急劇下降, 自7dph開始維持在0.07—0.08, 口寬和全長處于同步發(fā)育期(圖2A), 二者呈現(xiàn)線性相關(guān)(R2=0.948, 圖2B)。

圖1 長吻?仔稚魚全長(A)和口寬(B)的發(fā)育以及與日齡的相關(guān)性Fig. 1 The relationships between (A) total length and (B) mouth width and developmental days in Chinese longsnout catfish larvae

2.2 消化酶

胃蛋白酶: 剛出膜仔魚胃蛋白酶活性較低0.89 U/(min·mg·protein)。出膜后活性顯著升高, 至8dph時(shí)初次達(dá)到最高值24.58 U/(min·mg·protein)。8—13dph時(shí), 胃蛋白酶活性處于緩慢下降的趨勢, 但各日齡間無顯著差異(P>0.05)。13dph后活性再次快速上升, 實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)達(dá)到最高39.63 U/(min·mg·protein) (圖3; P<0.05)。

胰蛋白酶: 表現(xiàn)出與胃蛋白酶相同的趨勢, 剛出膜時(shí)較低, 5—7dph顯著高于初孵仔魚, 8dph時(shí)繼續(xù)升高至2.70 U/(min·mg·protein)。8—13dph時(shí), 活性在最高水平平穩(wěn)的波動(dòng)。14dph日齡時(shí)胰蛋白酶活性顯著降低, 15dph又顯著升高(圖4; P<0.05)。

脂肪酶: 自出膜后仔魚脂肪酶活性就一直處于上升期, 于8dph顯著升高, 并于12dph 時(shí)初次達(dá)到最高: 79.37 U/(min·g·protein)。8—12dph時(shí)各取樣時(shí)間點(diǎn)上的脂肪酶活性無顯著差異(P>0.05)。13dph時(shí)脂肪酶活性顯著下降至5—7dph時(shí)的水平。14—15dph又恢復(fù)至12dph時(shí)的水平 (圖5; P<0.05)。

淀粉酶: 自出膜后仔魚淀粉酶活性就一直處于上升期, 于8dph顯著升高后又顯著下降至6—7dph水平, 直到15dph日齡時(shí)才顯著上升至8dph水平(圖6; P<0.05)。

3 討論

圖2 長吻?仔稚魚發(fā)育過程中的口寬/全長比(A)及口寬與全長的相關(guān)性(B)Fig. 2 The relationships between (A) ratio of mouth width / total length and developmental days and (B) mouth width and total length in Chinese longsnout catfish larvae

圖3 長吻?仔稚魚發(fā)育過程中胃蛋白酶活性變化Fig. 3 Variation of pepsin activity in Chinese longsnout catfish during larval development

圖4 長吻?仔稚魚發(fā)育過程中胰蛋白酶活性變化Fig. 4 Variation of trypsin activity in Chinese longsnout catfish during larval development

圖5 長吻?仔稚魚發(fā)育過程中脂肪酶活性變化Fig. 5 Variation of lipase activity in Chinese longsnout catfish during larval development

圖6 長吻?仔稚魚發(fā)育過程中淀粉酶活性變化Fig. 6 Variation of amylase activity in Chinese longsnout catfish during larval development

在本實(shí)驗(yàn)中, 在初孵仔魚中均可檢測出4種消化酶的活性。仔魚孵化后第5天也就是仔魚開口的當(dāng)天, 胰蛋白酶活性顯著高于初次孵化出來的仔魚,胃蛋白酶、脂肪酶活性在仔魚孵化后第7天即開口后的第3天, 淀粉酶活性在孵化后第6天, 顯著高于初次孵化出來的仔魚, 這說明長吻?在初次開口時(shí)就已為外源性餌料做好了準(zhǔn)備。消化酶活性在仔魚開口前就在體內(nèi)檢測到的現(xiàn)象在許多魚類中均有報(bào)道[14—22]。學(xué)者們認(rèn)為這些酶的發(fā)育決定著仔魚消化外來食物的時(shí)間[23]。魚蝦消化道中相當(dāng)重要的消化酶, 可以激活消化道內(nèi)其他消化酶類[23—27]。仔魚開口攝食時(shí)間往往與仔魚體內(nèi)胰蛋白酶原或者胰蛋白酶含量以及胰蛋白酶活性密切相關(guān)[6,14,24,28—30]。關(guān)鍵性酶的出現(xiàn)是仔魚消化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)[23,31]。在本實(shí)驗(yàn)中胰蛋白酶活性在仔魚開口初期就顯著高于初孵仔魚與上述學(xué)者的研究結(jié)果相一致。在本實(shí)驗(yàn)中, 長吻?仔魚開口攝食之后, 胃蛋白酶、胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性均表現(xiàn)出先快速升高,繼而下降, 維持在一定的水平, 至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)又升高的趨勢。這種發(fā)育過程中酶活性最初升高, 繼之下降, 最后維持在一個(gè)相對(duì)固定的水平是脊椎動(dòng)物包括魚類在內(nèi)的發(fā)育階段的一個(gè)顯著的特征表現(xiàn)[32,33]。

一般而言, 仔魚發(fā)育階段消化酶的變化主要有兩方面原因造成: (1)餌料組成成分的影響; (2)不同消化器官生長和發(fā)育的影響。個(gè)體發(fā)生過程中, 消化酶活性的發(fā)生有兩個(gè)關(guān)鍵性的時(shí)期, 即仔魚內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)的轉(zhuǎn)換期以及仔魚向稚魚的轉(zhuǎn)變期。眾多的實(shí)驗(yàn)表明: 各種消化酶的發(fā)育模式是和消化道各器官發(fā)育完善的水平密切相關(guān)的。功能性胃的出現(xiàn)被學(xué)者們認(rèn)為是仔魚發(fā)育的最后一步,至此以后, 仔魚開始獲得類似于幼魚的消化特性[34]。在功能性胃出現(xiàn)前, 沒有酸的分泌以及胃蛋白酶消化的發(fā)生, 蛋白的消化主要由堿性蛋白酶(如胰蛋白酶和糜蛋白酶)[15,35]來完成。在仔魚發(fā)育過程中, 胰蛋白酶和糜蛋白酶活性逐漸減弱的同時(shí)胃蛋白酶及其類似物的活性逐漸升高意味著魚類消化功能逐漸由堿性向酸性蛋白酶轉(zhuǎn)變[36]。類胃蛋白酶最終成為主要的消化酶。在本實(shí)驗(yàn)中, 自仔魚開口后, 胃蛋白酶活性一直升高, 至8—13dph達(dá)到平臺(tái)期, 升高幅度高達(dá)20倍, 說明在這一時(shí)期, 長吻?仔魚的胃處于快速發(fā)育期, 這也與長吻?消化道外在形態(tài)發(fā)育相一致: 5dph時(shí), 長吻?仔魚消化道剛剛開始彎曲,消化管前段開始膨大, 至8dph時(shí), 這一膨大部分形成胃。因此可以認(rèn)為, 5—8dph是長吻?仔魚胃部發(fā)育的重要時(shí)期, 是長吻?仔魚由堿性消化為主向酸性蛋白酶消化為主的轉(zhuǎn)換時(shí)期。

本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示隨著胃蛋白酶活性的增強(qiáng),胰蛋白酶活性也逐漸增強(qiáng), 與胃蛋白酶同一天達(dá)到一個(gè)最高點(diǎn), 這種變化趨勢與Zambonino Infante 和Cahu[14]在歐洲鱸仔魚中的報(bào)道類似, 但與Chen, et al.[37]在黃尾?仔魚的研究不同, 黃尾?仔魚隨著胃腺的發(fā)育, 胃部逐漸的功能化, 胃蛋白酶的活性逐漸增強(qiáng), 胰蛋白酶的活性逐漸減弱。這種發(fā)育趨勢的差異也許是由于魚類的不同種類以及不同的生長發(fā)育環(huán)境造成的。

從口寬和全長的發(fā)育以及口寬全長比可以看出在仔魚孵化后第7天, 仔魚的口寬與全長即進(jìn)入同步快速發(fā)育期, 這與胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性初次顯著高于初孵仔魚的時(shí)間相一致。代田昭彥[38]認(rèn)為魚類的口器變化與攝食密切相關(guān), 口裂關(guān)系到捕獲餌料的機(jī)能, 口寬決定攝食餌料的大小,仔魚期的口徑隨體長的增加而增大, 同時(shí), 口徑比(口徑與全長的比值)也發(fā)生變化。孵化后不久的仔魚, 其口徑比隨體長的增加而迅速增大, 但到某一時(shí)期, 就開始縮小。仔魚期這種口徑比的變化和食性有密切關(guān)系。口徑比轉(zhuǎn)折點(diǎn)時(shí)的體長依魚種類而異, 似乎以這個(gè)體長為界線發(fā)生了食性的變化。本實(shí)驗(yàn)中, 仔魚消化酶活性初次達(dá)到最高出現(xiàn)在仔魚開口攝食之后即仔魚由內(nèi)源性營養(yǎng)向外源性營養(yǎng)的轉(zhuǎn)變期, 而口徑比在其孵化7d后即處于一個(gè)平穩(wěn)的波動(dòng)期, 從這種仔魚形態(tài)學(xué)與消化酶發(fā)育的一致性中我們可以推測長吻?仔魚自孵化后第8天消化功能趨于完善[24], 標(biāo)志著仔魚轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī)的開始。

仔魚發(fā)育期消化酶活性的變化到底是其自身發(fā)育的自然過程還是由于攝取的外源性活餌刺激所造成的, 學(xué)者們一直存在爭議, 但是近年來一些學(xué)者的實(shí)驗(yàn)證明活餌刺激對(duì)仔魚消化酶活性的影響幾乎可以忽略不計(jì)[19,24,36,39,40]。在本實(shí)驗(yàn)中為了避免外源性營養(yǎng)物質(zhì)對(duì)仔魚消化酶的影響, 所有取樣均在仔魚投喂前進(jìn)行, 所觀察到的消化酶的發(fā)育趨勢應(yīng)該被認(rèn)為是仔魚自身消化酶消化能力的表現(xiàn), 而不是由攝取外來活餌造成的。正如在其他脊椎動(dòng)物中所觀察到的一樣, 魚類消化酶的發(fā)生和個(gè)體發(fā)育過程中的變化是受其遺傳因素的調(diào)控的[41]。

綜上所述, 4種消化酶活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說明長吻?仔稚魚消化功能在孵化后6—8dph逐漸完善。胰蛋白酶活性可以作為長吻?仔魚初次開口與否的評(píng)價(jià)指標(biāo)。7dph后長吻?仔魚口寬和全長處于同步發(fā)育期, 標(biāo)志著長吻?仔魚轉(zhuǎn)食時(shí)機(jī)的開始, 可以嘗試在此時(shí)期投喂人工配合餌料。確切的人工配合飼料投喂時(shí)間則需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來確定。

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VARIATION OF DIGESTIVE ENZYMES AND MOUTH WIDTH DURING LARVAL DEVELOPMENT OF CHINESE LONGSNOUT CATFISH (LEIOCASSIS LONGIROSTRIS GüNTHER) FED WITH ARTEMIA

LIU Bian-Zhi1,2, ZHU Xiao-Ming1, LEI Wu1, HAN Dong1, YANG Yun-Xia1, JIN Jun-Yan1and XIE Shou-Qi1
(1. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. Henan Agricultural University, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Zhengzhou 450002, China)

Ontogentic changes of four digestive enzymes (amylase, lipase, trypsin, pepsin) and the morphological parameters of total length and mouth width were investigated in Chinese longsnout catfish larvae fed with Artemia. The experiment lasted for 13 days. The results showed that 1) total length (TL) and mouth width (MW) of the larvae increased linearly with time after hatching (R2TL= 0.974, R2MW= 0.964; P<0.05). The ratio of mouth width to total length decreased from 5 to 7dph (days after hatching) (P<0.05) and then reached to a plateau at 0.07—0.08. The fact that mouth width developed synchronically with total length from 7dph indicated the beginning of the weaning time. All the digestive enzymes were detected at the first feeding. Trypsin activity was significant higher in 5—7dph larvae than that of the newly hatched fish, which accompanied the first feeding behavior at 5dph. Pepsin and lipase activities in 7dph larvae and amylase activities in 6dph larvae were significantly higher than that of the newly hatched larvae. The high and stable activities of the digestive enzymes during 8—13dph indicated that the digestive tract was fully developed.

Leiocassis longirostris Günther; Digestive enzyme; Larvae; Mouth width; Total length

S962

A

1000-3207(2013)01-0125-07

10.7541/2013.125

2011-12-02;

2012-10-30

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-46-19); 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))專項(xiàng)“水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物營養(yǎng)需求與高效配合飼料開發(fā)(201003020)”; 公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)“飼料高效低耗加工技術(shù)研究與示范(201203015)”公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)“淡水池塘工程化改造與環(huán)境修復(fù)技術(shù)研究與示范(201203083)”資助

劉變枝(1981—), 女, 河南開封人; 博士研究生; 研究方向?yàn)轸~類生理生態(tài)學(xué)。E-mail: liubianzhi@126.com

解綬啟, E-mail: sqxie@ihb.ac.cn