樓林 方晴霞 鄭小春 茹國(guó)慶 馬杰 盧剛

多形性腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中1p/19q雜合性缺失的表達(dá)及其意義

樓林 方晴霞 鄭小春 茹國(guó)慶 馬杰 盧剛

目的探討多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）中1p/19q雜合性缺失（1p/19q LOH）的表達(dá)類型及其意義。方法通過(guò)熒光原位雜交法檢測(cè)29例GBM、17例間變性星形細(xì)胞瘤（AA）和12例少突星形細(xì)胞瘤（OA）中1p/19q LOH的表達(dá)及其差異。結(jié)果GBM、AA和OA中1p/19q LOH的發(fā)生率分別為24.1%、35.3%和75.0%，其中同時(shí)發(fā)生1p和19q LOH的比率分別為13.8%、23.5%和66.7%，GBM中1p/19q LOH的發(fā)生率明顯低于AA和OA（P＜0.05）。GBM的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率和Ki-67增殖指數(shù)分別為75.9%和87.66±16.21，AA為47.1%和49.57±4.73，OA為41.7%和41.62±4.25，GBM與后兩者比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。1p/19q LOH的發(fā)生率與VEGF陽(yáng)性表達(dá)和Ki-67增殖指數(shù)呈負(fù)相關(guān)（均P＜0.05）。結(jié)論1p/19q LOH的表達(dá)可能有助于評(píng)估GBM患者對(duì)烷化劑類藥物治療的敏感性及其預(yù)后。

多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤 1p/19q雜合性缺失 化療 預(yù)后

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the loss of heterozygosity of 1p and/or 19q chromosomal arms(1p/19q LOH)in glioblastoma multiforme(GBM)and its significance.MethodsThe 1p/19qLOH patterns in 29 cases of GBM,17 cases of anaplastic astrocytoma(AA)and 12 cases of oligodendroglioma(OA)were examined by using fluorescence in situ hybridization (FISH)method.Results1p/19q whole loss was observed in 13.8%of GBM cases,23.5%of AA and 66.7%of OA.The rate of 1pLOH or 19qLOH in GBM,AA and OA cases was 24.1%,35.3%and 75.0%respectively.The 1p/19qLOH rate in GBM was significantly lower than that in AA and OA(P＜0.05).The positive expression of VEGF and Ki-67 proliferating index(Ki-67 PI)were 75.9%and 87.66±16.21 in GBM,47.1%and 49.57±4.73 in AA and 41.7%and 41.62±4.25 in OA respectively.The positive expression of VEGF and Ki-67 PI in GBM was significantly higher than that in AA and OA groups(P＜0.05).The 1p/19qLOH was negatively correlated with expression of VEGF,and Ki-67 PI(P＜0.05).ConclusionThe 1p/19qLOH may be an useful genetic marker to estimate chemotherapeutic sensitivity and prognosis of GBM.

近年來(lái)，腫瘤耐藥因子O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methylguannine-DNA methyltransferase，MGMT）已成為多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma multiform，GBM）化療有效性的分子標(biāo)記物，但隨著研究的深入，MGMT的局限性和可靠性問(wèn)題日益顯現(xiàn)，因此尋找新的可靠的標(biāo)記物成為GBM研究的焦點(diǎn)。根據(jù)國(guó)內(nèi)外的研究現(xiàn)狀，本研究檢測(cè)染色體1p/19q在GBM、間變性星形細(xì)胞瘤（anaplastic astrocytoma，AA）及少突星形細(xì)胞瘤（oligodendroglioma，OA）樣本中的表達(dá)，并結(jié)合臨床探討1p/19q雜合性缺失（1p/19q loss of heterozygosity，1p/ 19q LOH）作為治療有效性輔助指標(biāo)的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010-09—2012-03在本院手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的58份腫瘤組織標(biāo)本，其中19份為低溫冰箱保存的液氮速凍標(biāo)本，39份為手術(shù)直接獲取的新鮮腫瘤組織。其中GBM29例，男26例，女3例，年齡27～41歲；AA17例，男9例，女8例，年齡29～62歲；OA12例，男9例，女3例，年齡19～57歲。

1.2 方法

1.2.1 組織學(xué)檢查 腫瘤組織標(biāo)本4%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規(guī)3μm切片，HE染色，按2007年《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類》的診斷分類標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤的病理類型和級(jí)別。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢查 采用免疫組化S-P法檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）、S-100蛋白（S-100）、神經(jīng)微絲（neurofilament，NF）、突觸素（synaptophysin，Syn）、少突膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子-2（oligodendrocyte transcription factor-2，Olig2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及Ki-67。標(biāo)本固定、切片后，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。GFAP、NSE、S-100、NF、Syn和Olig2常規(guī)用于GBM、AA和OA的病理診斷，以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)黃染為陽(yáng)性；VEGF以細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性表達(dá)，＜5%為陰性表達(dá)。Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核呈顆粒狀棕黃色，Ki-67增殖指數(shù)（proliferation index,PI）以高倍鏡下1 000個(gè)細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率來(lái)表示。

1.2.3 熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH） 腫瘤標(biāo)本常規(guī)固定、切片，采用熒光原位雜交1p/19q雙色探針試劑盒（LSI 1p36/1q25和19q13/19p13雙色探針，Vysis公司）檢測(cè)標(biāo)本中1p/19qLOH。在熒光顯微鏡下選取主要的異常區(qū)域，觀察200個(gè)細(xì)胞中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)靶信號(hào)（TS）=0/1及對(duì)照信號(hào)（CS）≥1的信號(hào)表達(dá)，1p/19q的正常表達(dá)為TS（紅色）2點(diǎn)，CS（綠色）2點(diǎn)，即TS=2，CS=2。1p/19qLOH的表達(dá)為：TS=0/1，CS≥1；1p/ 19q表達(dá)失衡為TS≥2，CS≥3或TS＜CS；其它類型的1p/19q表達(dá)異常包括TS＞CS、單倍體和多倍體等。判讀計(jì)數(shù)結(jié)果，雜合性維護(hù)（heterozygosity in maintenance，MH）的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為1p/19q正常表達(dá)細(xì)胞的百分率≥20%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料均以表示，組間比較采用方差分析，計(jì)數(shù)資料的組間比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher確切概率法。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)診斷 根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、組織學(xué)檢查和免疫組化（GFAP、NSE、S-100、NF、Syn和Olig2）結(jié)果，29例GBM中原發(fā)性17例、繼發(fā)性12例，其中按WHO分級(jí)Ⅲ～Ⅳ級(jí)5例、Ⅳ級(jí)24例；17例AA中星形細(xì)胞瘤4例（WHOⅡ級(jí)）、AA 13例（WHOⅡ～Ⅲ級(jí)）；12例OA中OA8例（WHOⅡ級(jí)）、間變性O(shè)A4例（WHOⅡ～Ⅲ級(jí)）。

2.2 免疫組化結(jié)果 GBM的VEGF陽(yáng)性率75.9%（22/29），AA為47.1%（8/17），OA為41.7%（5/12），GBM與AA、OA間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05），AA和OA間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。GBM的Ki-67 PI平均（87.66±16.21）%，AA平均（49.57±4.73）%，OA平均（41.62±4.25）%。GBM明顯高于AA和OA，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）。

2.3 1p/19qLOH 29例GBM中，7例（24.1%）符合1p/ 19qLOH的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，其中2例1pMH，1例19qMH，4例（13.8%）同時(shí)發(fā)生1pLOH和19qLOH（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。17例AA中，6例（35.3%）符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，其中2例1pMH，4例（23.5%）同時(shí)發(fā)生1pLOH和19qLOH。12例OA中，9例（75.0%）符合陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，其中1例1pMH，8例（66.7%）同時(shí)發(fā)生1pLOH和19qLOH。GBM中1p/19qLOH的發(fā)生率以及同時(shí)發(fā)生1pLOH和19qLOH的比率明顯低于AA和OA（均P＜0.05）。

2.4 1p/19qLOH與VEGF、Ki-67 PI的關(guān)系 GBM腫瘤細(xì)胞1p/19qLOH的發(fā)生率與VEGF陽(yáng)性表達(dá)和Ki-67 PI均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.643或-0.847，均P＜0.05），而VEGF陽(yáng)性表達(dá)與Ki-67 PI呈正相關(guān)（r=0.921，P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同腫瘤細(xì)胞免疫組化和1p/19qLOH結(jié)果的關(guān)系比較

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是一種環(huán)境誘導(dǎo)的多因素疾病，基因組穩(wěn)定性喪失和免疫監(jiān)控能力低下是伴隨整個(gè)腫瘤發(fā)生過(guò)程的兩個(gè)重要標(biāo)志性事件。由于惡性腦膠質(zhì)瘤是一類分子水平高度異質(zhì)性的疾病，即便組織學(xué)形態(tài)相同，由于其分子遺傳學(xué)的差異最終可導(dǎo)致治療反應(yīng)和預(yù)后的不同，因此，基于分子病理分型的個(gè)體化治療是未來(lái)的治療方向。目前獲得公認(rèn)的預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤療效和生存預(yù)后的分子病理分型標(biāo)志物有：1p/19qLOH、MGMT失活和EGFR-P13K通路激活[1-2]。

1p/19qLOH是OA相對(duì)特異性的一種分子遺傳學(xué)改變。早在1992年，Ransom等[3]的研究證實(shí)了在OA中存在染色體1p和19qLOH。1998年，Cairncross等[4]首次報(bào)道了間變性O(shè)A中1p/19qLOH對(duì)臨床治療的意義，1pLOH的OA患者對(duì)PCV方案聯(lián)合化療敏感，同時(shí)發(fā)生1p和19qLOH的患者對(duì)化療的敏感性更高，治療的總有效率達(dá)60%～70%，生存時(shí)間明顯長(zhǎng)于同級(jí)別的AA。此后眾多的相關(guān)研究也證實(shí)，不同級(jí)別的OA發(fā)生1p/19qLOH的百分率基本相同，而相應(yīng)級(jí)別的其他星形細(xì)胞瘤發(fā)生1p/19qLOH的百分率明顯降低；1p/19qLOH陰性患者的中位生存時(shí)間為2～3年，而1p/19qLOH陽(yáng)性患者的中位生存時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)6～7年[5-6]。本研究GBM、AA和OA中1p/19qLOH的發(fā)生率分別為24.1%、35.3%和75.0%，其中同時(shí)發(fā)生1p和19qLOH的百分率分別為13.8%、23.5%和66.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本相同。

GBM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前的研究發(fā)現(xiàn)，GBM發(fā)生時(shí)的基因丟失遍布整個(gè)基因組，影響到幾乎所有的染色體，其中10號(hào)染色體上等位基因缺失的發(fā)生率最高[7]。研究表明，GBM發(fā)生10qLOH提示預(yù)后不良，而1p/19qLOH，尤其是1p和19qLOH同時(shí)發(fā)生則表示GBM可能對(duì)放、化療敏感，預(yù)后相對(duì)較好。多數(shù)研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，GBM中1p/19qLOH同時(shí)發(fā)生的概率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于OA[8]。本研究中，GBM中符合1p/19qLOH的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)的達(dá)24.1%，而同時(shí)發(fā)生1p/19qLOH百分率僅為13.8%。雖然1p和19q的分子遺傳學(xué)背景以及1p/ 19qLOH患者預(yù)后較好的原因至今尚不清楚，甚至1p和19q位點(diǎn)的基因檢測(cè)也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的抑癌基因，但是1p/ 19qLOH可能提示GBM對(duì)化療敏感且預(yù)后相對(duì)較好[8]。

VEGF是目前發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)、特異性最高的促進(jìn)腫瘤血管生成因子，主要與腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)特性有關(guān)，其表達(dá)主要受p13K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的調(diào)控。Yao等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與VEGF陰性的膠質(zhì)瘤相比，VEGF陽(yáng)性的低級(jí)別星形細(xì)胞瘤和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的生存期明顯縮短。此外，相應(yīng)的抗VEGF單克隆抗體也是分子靶向治療中一個(gè)研究熱點(diǎn)。在一項(xiàng)貝伐單抗聯(lián)合伊立替康治療復(fù)發(fā)性GBM的Ⅱ期臨床研究中，35例患者中有57%獲得部分緩解，中位生存時(shí)間42周，有7例患者完成1年治療，其中6例患者的PET檢查提示腫瘤病灶呈低代謝狀態(tài)[10]。本研究顯示，GBM中VEGF的陽(yáng)性率明顯高于AA和OA，且與代表膠質(zhì)瘤惡性程度及腫瘤細(xì)胞增殖活性的Ki-67 PI呈正相關(guān)，而與1p/19qLOH的百分率呈負(fù)相關(guān)。這表明腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增加而顯著增生，并間接的促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)；而隨著腫瘤惡性程度的增高，腫瘤細(xì)胞本身的增殖速率也明顯升高。因此，VEGF和Ki-67 PI可以作為臨床上評(píng)估GBM侵襲性生長(zhǎng)特性、惡性進(jìn)展程度以及治療反應(yīng)的客觀指標(biāo)。

本研究認(rèn)為，GBM中發(fā)生1p/19qLOH意味著腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感且患者的預(yù)后相對(duì)較好，因此，1p/ 19qLOH的百分率可作為GBM化療藥物敏感性及其預(yù)后評(píng)估的合適指標(biāo)，而治療前后VEGF和Ki-67 PI的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)則有助于對(duì)個(gè)體化治療的效果做出客觀評(píng)估。

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Loss of heterozygosity of 1p/19q in glioblastoma multiforme and its significance

GBM 1p/19qLOH ChemotherapyPrognosis

2013-03-04）

（本文編輯：胥昀）

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310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院神經(jīng)外科（樓林、盧剛），藥學(xué)部（方晴霞、鄭小春），病理科（茹國(guó)慶、馬杰）

盧剛，E-mail：lugg@msn.cn