張鈞書 王科 黃建

腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志CD166在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其臨床生物學(xué)意義

張鈞書 王科 黃建

目的探討腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志CD166在原發(fā)結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其臨床生物學(xué)意義。方法收集57例患者的原位結(jié)腸癌組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)其CD166表達(dá)。應(yīng)用流式細(xì)胞分選（FACS）技術(shù)，以CD166/CD133標(biāo)志分選結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，通過(guò)NOD/SCID小鼠脾臟移植，觀察肝轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果CD166可表達(dá)于結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，其中細(xì)胞質(zhì)陽(yáng)性率98.2%（56/57），細(xì)胞膜陽(yáng)性率42.1%（24/57）。膜CD166陽(yáng)性表達(dá)與局部浸潤(rùn)（P=0.010）、pTNM分期（P=0.035）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.013）、年齡（P=0.026）相關(guān)；而與性別（P=0.426）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.104）、腫瘤分化（P=0.171）無(wú)相關(guān)性。Log-rank生存分析顯示：結(jié)腸癌細(xì)胞膜CD166陽(yáng)性表達(dá)與患者生存期（P=0.014）呈負(fù)相關(guān)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的初步結(jié)果顯示：脾包膜接種CD166陽(yáng)性的SW620細(xì)胞可形成肝轉(zhuǎn)移灶。結(jié)論CD166陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤局部進(jìn)展和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，是判斷預(yù)后不良的標(biāo)志，CD166陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞可能具有肝轉(zhuǎn)移潛能。

結(jié)腸癌 CD166 CD133 預(yù)后 肝轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，占胃腸道腫瘤的第二位，發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)[1]。由于早期無(wú)癥狀，相當(dāng)數(shù)量的患者發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)已處于中晚期，從而導(dǎo)致治療效果不佳，外科手術(shù)和放、化療均不能徹底根除體內(nèi)存留的腫瘤細(xì)胞[2]。目前大部分研究結(jié)果顯示腫瘤組織中存在極少數(shù)具有無(wú)限增殖和自我更新能力，可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cells，CSC）。CSC可能是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和耐藥的主要因素[3-4]，近年來(lái)已成為腫瘤的研究熱點(diǎn)，CSC分子標(biāo)志物表達(dá)在治療選擇和預(yù)后判斷上具有重要意義。研究顯示CD166可能是結(jié)腸癌干細(xì)胞標(biāo)志之一，本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸癌組織CD166的表達(dá)，了解其與腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系；并以CD166標(biāo)志分選結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，移植入NOD/SCID小鼠脾臟，觀察其肝轉(zhuǎn)移的能力。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2007-01—2010-01在浙江省臨安市人民醫(yī)院手術(shù)的57例結(jié)腸癌患者的石蠟標(biāo)本，經(jīng)浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科醫(yī)師確診，所有患者術(shù)前未接受放、化療，臨床病理資料完整。其中男37例，女20例，年齡33～86歲，平均64.5歲。病變部位左半結(jié)腸34例，右半結(jié)腸23例。按全國(guó)結(jié)直腸癌協(xié)作組標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行組織學(xué)分類，其中高分化7例、中分化28例、低分化22例。浸及漿膜和漿膜外組織54例，未超過(guò)肌層3例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例。TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)癌癥分期手冊(cè)2010年第7版，Ⅰ期3例、Ⅱ期27例、Ⅲ期20例、Ⅳ期7例。57例中失訪5例，死亡12例。18例遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，依次是肝臟、腹腔、腹膜、肺，其中肝轉(zhuǎn)移10例。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 5周齡雄性NOD/SCID小鼠，體重20g左右，購(gòu)自中科院上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心無(wú)特殊病原體（specific pathogen free,SPF）級(jí)動(dòng)物房。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗人 CD166濃縮型單克隆抗體（工作液濃度1∶50），購(gòu)自英國(guó)abcam公司；即用型免疫組化試劑盒（SP-9000）,購(gòu)自福州邁新生物有限公司。人結(jié)腸腺癌細(xì)胞SW620，由浙江大學(xué)腫瘤研究所提供。流式分選用鼠抗人CD166單克隆抗體、PE羊抗鼠免疫球蛋白均購(gòu)自美國(guó)BD公司；CD133/2(AC14l)-FITC熒光抗體購(gòu)于德國(guó)Miltenyin公司；流式細(xì)胞儀為美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)腸癌組織中CD166表達(dá)具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，DAB顯色。結(jié)果判斷：細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)分別判斷，出現(xiàn)黃色顆粒為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞占視野細(xì)胞數(shù)的百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性，10%～49%為+，50%～74%為++，＞75%為+++。并請(qǐng)2位病理科醫(yī)師雙盲確認(rèn)。

1.4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分選 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620采用RPMI1640完全培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2孵箱中貼壁培養(yǎng)。收集2×106個(gè)細(xì)胞，用冷的PBS 2ml洗滌1次后，以含2%FBS的PBS封閉10min，分成5管（CD133、CD166、CD133/CD166、對(duì)照、空白）。加入一抗后，冰上避光放置30min，洗滌去掉未結(jié)合的一抗。加入熒光標(biāo)記的二抗，冰上避光放置10min后，洗滌兩次。取500μl細(xì)胞懸液上流式細(xì)胞儀分析。同時(shí)準(zhǔn)備3μl無(wú)血清培養(yǎng)液用于細(xì)胞分選。

1.4.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 采用0.5%的戊巴比妥鈉50mg/kg，小鼠腹腔內(nèi)注射麻醉，麻醉成功后用膠布將小鼠固定于手術(shù)臺(tái)上。皮膚消毒后左側(cè)肋緣下行0.5～1cm切口，進(jìn)腹后找到柳葉狀脾臟，牽出腹腔外，用1ml注射器從脾下極進(jìn)針，將瘤細(xì)胞液0.1ml注射于脾內(nèi)，拔針后，酒精棉球按壓針眼，輕輕按揉脾臟5min，使瘤細(xì)胞經(jīng)脾靜脈進(jìn)入肝臟，注射區(qū)蒼白隆起消失后，結(jié)扎脾血管及胃短動(dòng)、靜脈，切除脾臟并關(guān)腹。麻醉清醒后常規(guī)飼養(yǎng)。定期觀察小鼠的一般狀況。所有小鼠飼養(yǎng)至自然死亡或至第8周行頸椎離斷法處死。解剖后觀察有無(wú)肝臟及其他部位轉(zhuǎn)移，取出肝臟及有轉(zhuǎn)移的組織,以4%甲醛固定。石蠟包埋后切片，HE染色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用2.15.0版R統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示。計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析，對(duì)生存數(shù)據(jù)進(jìn)行Kaplan-Meier分析并繪制生存曲線，應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)差異性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中CD166表達(dá) 免疫組化結(jié)果提示57例結(jié)腸癌組織中細(xì)胞質(zhì)表達(dá)陽(yáng)性率為 98.2%（56/ 57），細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)率為42.1%（24/57）（圖1，見插頁(yè)）。

2.2 結(jié)腸癌細(xì)胞膜CD166表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 本研究結(jié)果顯示年齡≥65歲的患者結(jié)腸癌組織 CD166陽(yáng)性率明顯高于＜65歲者（P＜0.05）。CD166陽(yáng)性表達(dá)亦與浸潤(rùn)深度有關(guān)，T3、T4患者CD166陽(yáng)性率明顯高于T1、T2患者（P＜0.05），CD166陽(yáng)性表達(dá)還與結(jié)腸癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（均P＜0.05）。而與性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（均P＞0.05），見表1。

2.3 結(jié)腸癌細(xì)胞膜CD166表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)CD166陰性表達(dá)患者生存時(shí)間明顯高于陽(yáng)性患者（P＜0.05），相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)0.23（95%可信區(qū)間0.0724～0.741），見圖2。

2.4 SW620細(xì)胞流式分選結(jié)果 以CD166/CD133為標(biāo)志，分選SW620細(xì)胞得出CD166+/CD133+的SW620細(xì)胞占 27.7%，CD166+/CD133-細(xì)胞 16.8%，CD166-/ CD133+細(xì)胞33.8%，而CD166-/CD133-細(xì)胞21.6%。

2.5 NOD/SCID小鼠肝臟轉(zhuǎn)移結(jié)果 脾包膜注射2×106個(gè)未分選SW620細(xì)胞和2×105個(gè)CD166-細(xì)胞的小鼠未出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移（0/2、0/1、0/1），而注射2×105個(gè)CD166+/ CD133+和CD166+/CD133-細(xì)胞可發(fā)生肝轉(zhuǎn)移（3/3、2/3）（圖3，見插頁(yè)）。

表1 結(jié)腸癌細(xì)胞膜CD166表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系[例（%）]

圖2 結(jié)腸癌CD166表達(dá)與患者生存曲線

3 討論

近年來(lái)，CSC已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中首先發(fā)現(xiàn)了一些CD133陽(yáng)性的細(xì)胞，其所占比例很小，但是有很強(qiáng)的增殖能力，具有CSC特征。隨著研究的深入，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了CD44、EpCAM、CD166等結(jié)直腸癌CSC的標(biāo)志物[5-6]。研究證實(shí)一些CSC標(biāo)志物與腫瘤臨床指標(biāo)相關(guān)，如目前已發(fā)現(xiàn)CD133、CD26等CSC的分子標(biāo)志與其肝轉(zhuǎn)移相關(guān)，其高表達(dá)提示結(jié)腸癌預(yù)后不良[7-12]。而CD166分子在結(jié)腸癌中的表達(dá)和生物學(xué)意義研究報(bào)道不多且有爭(zhēng)議，需進(jìn)一步研究闡明。

CD166（ALCAM）是分子量為65KDa細(xì)胞黏附分子，屬于免疫球蛋白超家族。在活化的白細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和血液前體細(xì)胞中存在生理性表達(dá)[13]。在腫瘤組織中，首先發(fā)現(xiàn)CD166是惡性黑色素瘤疾病進(jìn)展有價(jià)值的預(yù)后判斷指標(biāo)[14-15]。近來(lái)有學(xué)者報(bào)道在結(jié)腸癌中細(xì)胞膜CD166表達(dá)與腫瘤進(jìn)展密切相關(guān)，是預(yù)后不良的判斷指標(biāo)[16-17]。但Lugli等[18]應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)胞膜不表達(dá)CD166、CD44的結(jié)腸癌細(xì)胞具有更高浸潤(rùn)性和淋巴轉(zhuǎn)移率，與生存期降低相關(guān)。本研究顯示結(jié)腸癌細(xì)胞質(zhì)CD166陽(yáng)性表達(dá)98.2%，但生物功能及意義尚不清楚。在結(jié)腸癌細(xì)胞膜陽(yáng)性表達(dá)42.1%，并與腫瘤浸潤(rùn)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，陽(yáng)性患者生存期較陰性者降低，并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化無(wú)關(guān)，但需更多病例數(shù)證明。Patel等[19]研究發(fā)現(xiàn)CD44、CD166膜陽(yáng)性細(xì)胞局限分布于腺管周圍，并隨著年齡的增長(zhǎng)，CD44、CD166的表達(dá)更加強(qiáng)。本研究也顯示在高齡結(jié)腸癌患者CD166陽(yáng)性表達(dá)增加，其原因尚不清楚。

CD166已知作為CD6的配體參與上皮細(xì)胞間的黏附作用[20]。在部分結(jié)腸腺瘤和結(jié)腸癌細(xì)胞膜上表達(dá)，可能通過(guò)同嗜性和異嗜性黏附介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用，參與機(jī)體多種病理生理過(guò)程，在腫瘤的進(jìn)展，主要是在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能起重要作用。免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌細(xì)胞膜CD166陽(yáng)性患者具有更高轉(zhuǎn)移發(fā)生率，主要是肝轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步驗(yàn)證CD166陽(yáng)性結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，筆者以CD166和CD133為標(biāo)志應(yīng)用FACS技術(shù)分選結(jié)腸癌細(xì)胞SW620，經(jīng)脾移植NOD/ SCID小鼠觀察肝轉(zhuǎn)移情況，并與未分選SW620細(xì)胞比較。初步結(jié)果顯示CD166+細(xì)胞比未分選或CD166-細(xì)胞具有更強(qiáng)的肝轉(zhuǎn)移能力，推測(cè)CD166可能是獨(dú)立的轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)的標(biāo)志。

總之，本研究提示在結(jié)腸癌中CD166+細(xì)胞具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，CD166可能是腫瘤預(yù)后的新標(biāo)志物和治療的潛在靶點(diǎn)，尚需積累更多病例，進(jìn)一步體內(nèi)外研究證明。

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Expression of CD166 in colon cancer and its biological significance

ObjectiveTo investigate the expression and biological significance of CD166 in primary colon cancer.MethodsThe expression of CD166 was detected by immunohistochemistry in tissue specimens from 57 patients with colon cancer of various pTNM stages.Human colon cancer SW620 cells were screened for positive expression of CD166 and CD133.The CD166 and CD133-positive SW620 cells were inoculated in spleen of NOD/SCID mice;then the ability of liver metastases of transplanted SW620 tumors was evaluated.ResultsThe CD166 was positively expressed in cytoplasm and membrane of colon cancer cells, being 98.2%(56/57)in cytoplasm and 42.1%(24/57)in membrane of cancer cells.CD166 membrane expression was significantly associated with older age(P=0.026),tumor stage(P=0.035),and distance metastasis(P=0.013),not with gender(P=0.426),lymph node metastasis(P=0.104)and tumor differentiation(P=0.171).Log-rank survival analysis revealed that CD166 membrane expression was negatively correlated with the survival of patient(P=0.014).The results of the animal experiments demonstrated metastatic growth in the liver after splenic capsule injection CD166+SW620 cells.ConclusionThe expression of membrane CD166 is associated with poor clinical outcome and short survival in the patient with colon cancer.CD166+colon cancer cells may have a potential of liver metastasis.

Colon cancerCD166 CD133 Prognosis Liver metastases

2012-12-04）

（本文編輯：胥昀）

教育部博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目（20100101110124）

310009 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤外科（張鈞書、王科、黃建，張鈞書系在職碩士研究生，現(xiàn)在臨安市人民醫(yī)院普外科工作）

張鈞書，E-mail：zhjunshu@163.com