靳文英， 喬正國(guó)， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

阿霉素誘導(dǎo)的心力衰竭小鼠心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)變化*

靳文英， 喬正國(guó)， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

目的： 觀察阿霉素誘導(dǎo)的充血性心力衰竭（心衰）小鼠心臟去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NET）的表達(dá)變化。

去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；阿霉素；充血性心力衰竭；交感神經(jīng)

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:458.)

在心力衰竭（心衰）的發(fā)生發(fā)展中，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)度激活是加重心功能惡化的重要因素。去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NET）位于腎上腺素能神經(jīng)突觸前膜上，屬于單胺類(lèi) Na+/Cl-依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其功能是將神經(jīng)元釋放的去甲腎上腺素（NE）再攝取回突觸前膜內(nèi)，對(duì)調(diào)控突觸間隙中的NE濃度、終止神經(jīng)沖動(dòng)信號(hào)、維持受體對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性極 為 重 要[1,2]。 既 往 研 究 發(fā) 現(xiàn) 心 衰 時(shí) 存 在 有 心 臟NET 的表 達(dá)和功 能異常[3-6]， 其介導(dǎo) 的 NE 再攝取減少，可能在心衰的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。既往研究多采用主動(dòng)脈結(jié)扎或心室快速起搏的方式來(lái)制備心衰動(dòng)物模型，但手術(shù)操作可能損傷心臟附近的交感神經(jīng)纖維，而手術(shù)打擊和心室快速起搏均會(huì)刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮，有可能會(huì)影響交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的測(cè)定。本研究利用阿霉素誘導(dǎo)的充血性心衰小鼠動(dòng)物模型，在不影響交感興奮性的前提下觀察心衰早期 NET在心臟的表達(dá)變化。

1 材料與方法

慢性充血性心衰小鼠模型的建立：雄性C57BL/6J 小 鼠 共 20 只， 年 齡 3～4 周， 體 重（25.5±2.8）g。分 為對(duì)照組和 阿霉 素組各 10 只。參 照 Teraoka 的方 法[7]，阿霉 素組小鼠給予鹽酸阿霉素（輝瑞制藥有限公司 ）腹腔注射 2 mg/kg，每 3天注射一次共 5次，以后則每 7天注射一次共 6次，累計(jì)用量 22 mg/kg；對(duì)照組小鼠給予腹腔注射同等量的生理鹽水。兩組小鼠均正常飲食喂養(yǎng)，第10周末做為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。行超聲心動(dòng)圖檢查檢測(cè)小鼠心功能。支配小鼠心臟的交感神經(jīng)節(jié)主要發(fā)自頸中—星狀神經(jīng)節(jié)復(fù)合體（middle cervical-stellate ganglion complex, MC-SGC），而 心 臟交 感 神經(jīng) NET mRNA在 MC-SGC 中表達(dá)，NET 則通過(guò)軸突運(yùn)送至心臟的交感神經(jīng)末梢突觸前膜上[8]。小鼠過(guò)量麻醉處死后，剪開(kāi)胸腔暴露心臟及主動(dòng)脈，于頸部中央分離雙側(cè)頸動(dòng)脈旁的頸交感神經(jīng)干，向下分離至主動(dòng)脈弓，摘取頸交感神經(jīng)節(jié)，并迅速摘取小鼠心臟，分別置于液氮中速凍，分離的頸交感神經(jīng)節(jié)和心臟標(biāo)本均凍存于 -70℃待測(cè)。分別稱(chēng)量每只小鼠心臟和體重，計(jì)算心臟重量與體重之比（HW/BW）。

超聲心動(dòng)圖：應(yīng)用超聲心動(dòng)圖儀（飛利浦公司 IE33）及 15 MHz 高頻探頭，小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像，獲得二維引導(dǎo)下 10個(gè)心動(dòng)周期的M型超聲心動(dòng)圖記錄。測(cè)量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVDd），收縮末期內(nèi)徑（LVDs）以及室間隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd），計(jì)算左心室舒張末期容積（LVEDV），LVEDV=7×LVDd3/ (2.4+LVDd)；左 心 室 收 縮 末 期 容 積（LVESV），LVESV=7×LVDs3/(2.4+LVDs)；并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF，%）=(EDV-ESV)/EDV，左心室短軸縮短率（FS，%）=（LVDd- LVDs）/LVDd；左心室質(zhì)量 (LV mass) =1.05[(IVS+LVPWd+LVDd)3-LVDd3]。

實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR 檢 測(cè) mRNA 的 表 達(dá)：小 鼠NET mRNA 表達(dá)于支配心臟的頸交感神經(jīng)節(jié)中，心臟的β1腎上腺素能受體則分布在心臟交感神經(jīng)末梢內(nèi)，取冰凍的頸交感神經(jīng)節(jié)（MC-SG 復(fù)合體）和心 臟 組 織 勻 漿 后，Trizol法 提 取 組 織 總 RNA， 溶于 無(wú) RNA 酶 水 中。 采 用 東 洋 坊 RT-PCR 試 劑 盒（TOYOBO，大阪，日本）逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得 cDNA， 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR(PCR 分 析 儀：DNA Engine OpticonR，Bio-Rad； 分 析 軟 件：Opticon Monitor 3, Bio-Rad)測(cè)定 mRNA 含量。NET 引物序列為：上游 5’-GCACCTCCATTCTGTTTGCGGT-3’；下 游 5’-GCTCAACGAACTTCCAACACAGC -3’； 腎 上 腺 素 能 受 體 β1-AR 引 物 序 列：上游 5’-TGTGACGGCCAGCATCG-3’; 下 游5’-GCAGGCTCTGGTAGCGAAA-3’； 內(nèi) 參 對(duì)照 采 用 磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)， 引 物 序 列 為上 游 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ ， 下游 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。 反 應(yīng)條 件 為：預(yù) 變 性 94℃ 3min， 變 性 94 ℃ 15 s， 退火 60 ℃ 15 s， 延 伸 72 ℃ 15 s， 共 40 個(gè) 循 環(huán)。以 GAPDH 作 為 內(nèi) 參， 計(jì) 算 相 對(duì) 表 達(dá) 量 =2-△Ct，△ Ct=Ct（ 目 的 基 因 ）-Ct（ 內(nèi) 參 基 因 ）。Ct值 為每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

Western Blot法 測(cè) 定 心 肌 蛋 白 的 表 達(dá)：取 適量冰凍心肌組織，應(yīng)用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟 PMSF）提取心肌組織總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司 ）測(cè)定蛋白濃度[9]；加入十二烷基磺酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃變性；進(jìn)行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；室溫封閉 2 h 后，將 PVDF 膜與一抗室溫下孵育 1h 并 4℃過(guò)夜，然后二抗室溫下孵育 1h；超敏化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影， 應(yīng) 用 Bio-Rad 凝 膠 圖 像 成 像 系 統(tǒng) 和 Quality one 軟件進(jìn)行掃描分析。兔抗鼠 NET 抗體購(gòu)自Alomone 公司（Alomone Labs, 耶路撒冷，以色列 ），兔抗鼠 TH 抗體購(gòu)自 Abcam 公司（劍橋市，馬薩諸塞州，美國(guó)）。

免疫組織化學(xué)染色：將小鼠心臟用 OCT包埋劑（SAKURA，洛杉磯，美國(guó)）包埋，于 -23℃切成 12 μm 厚的冰凍切片。取小鼠左心室冰凍切片，將 切 片 在 預(yù) 冷 的 10% 甲 醛 溶 液 中 固 定 10 min，PBS 磷酸鹽緩沖液（135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4, pH7.4）沖洗 3 次，滴加血清封閉液封閉 30 min 后，一抗 4℃過(guò)夜，常溫 復(fù) 溫 30 min，PBS 沖 洗 3 次；二 抗 37 ℃ 孵 育20 min，PBS 沖洗 3 次后滴加 SABC 溶液 20 min，PBS沖洗 3次，二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色，蒸餾水沖洗，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察（Leica DM 4000B）。SABC（鏈霉親和素—生物素復(fù)合物）免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物公司，Masson 染色試劑盒購(gòu)自上海江萊生物公司，并按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色[10]。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 10.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)兩組均數(shù)的比較采用兩樣本的t檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠臨床及超聲結(jié)果：兩組小鼠分別腹腔注射阿霉素和生理鹽水，在實(shí)驗(yàn)第 10周末，對(duì)照組小鼠生長(zhǎng)良好，體重 (27.68±1.96) g，精神狀態(tài)好。阿霉素組小鼠 10周末死亡 2只，存活的 8 只小鼠體重（23.52±1.62） g，較對(duì)照組明顯減輕（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且存在精神萎靡的表現(xiàn)，但兩組小鼠心臟/體重比值無(wú)明顯變化。行超聲心動(dòng)圖檢查測(cè)定小鼠左心室收縮末及舒張末內(nèi)徑，并計(jì)算心功能指標(biāo)。阿霉素組小鼠經(jīng)小劑量多次阿霉素腹腔注射后，與對(duì)照組比較心肌運(yùn)動(dòng)幅度明顯減弱（圖1），左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率明顯降低，左心室收縮末期內(nèi)徑、左心室舒張末容積、左心室質(zhì)量明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05～0.01，表1），Masson 染色提示阿霉素組小鼠心肌纖維化較對(duì)照組增多（圖2）。

心衰小鼠心臟 NET的 mRNA 表達(dá)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 的方法測(cè)定小鼠頸交感神經(jīng)節(jié)中 NET 的 mRNA表達(dá)量無(wú)明顯變化。同時(shí)我們檢測(cè)了心臟腎上腺素能受體 β1-AR 的表達(dá)，結(jié)果顯示心衰小鼠心臟 β1-AR 的 mRNA 表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

阿霉素組心衰小鼠心臟 NET的蛋白表達(dá)：采用Western blot方法檢測(cè)小鼠心臟中 NET 的蛋白表達(dá)量。如圖3所示，阿霉素組小鼠心臟組織NET的蛋白表達(dá)量明顯較對(duì)照組降低（P＜0.05），并且 NE 合成限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的蛋白表達(dá)量顯著增加（圖3，P＜0.05）。進(jìn)一步用免疫組化方法檢測(cè)TH染色陽(yáng)性的交感神經(jīng)纖維密度，如圖4所示，阿霉素組和對(duì)照組小鼠心臟交感神經(jīng)纖維密度沒(méi)有明顯差異。

表1 小鼠超聲心動(dòng)圖測(cè)量指標(biāo)（±s）

圖1 實(shí)驗(yàn)第 10 周末小鼠 M 型超聲心動(dòng)圖

圖2 小鼠左心室 Masson 染色

圖3 小鼠心臟中 NET 和 TH 的蛋白表達(dá)

圖4 小鼠左心室交感神經(jīng)纖維密度

3 討論

在心衰的發(fā)生發(fā)展中，交感神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)度激活是加重心功能惡化的重要因素。目前一致認(rèn)為，阻斷神經(jīng)內(nèi)分泌的過(guò)度激活，防治心肌重構(gòu)是 治 療 心 衰 的 關(guān)鍵[11,12]。NET 位 于 交 感 神 經(jīng) 突觸前膜上，對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控具有重要作用，但其在心衰中的作用尚不清楚。本文研究結(jié)果證實(shí)在阿霉素誘導(dǎo)的慢性充血性心衰小鼠模型中，在交感神經(jīng)纖維密度無(wú)明顯變化的心衰早期，小鼠心臟 NET 的蛋白表達(dá)量下調(diào)，TH 蛋白表達(dá)增加，提示心衰早期時(shí) NET 的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致 NE 再攝取減少，心臟 NE蓄積致突觸前NE儲(chǔ)備耗竭，NE的合成代償性增加。

既往研究多采用主動(dòng)脈結(jié)扎或心室快速起搏來(lái)制備心衰動(dòng)物模型，但手術(shù)操作可能損傷心臟附近的交感神經(jīng)纖維，而手術(shù)打擊和心室快速起搏均會(huì)刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)的興奮，有可能會(huì)影響交感神經(jīng)系統(tǒng)功能的測(cè)定。阿霉素具有很強(qiáng)的心臟毒性，其累積的毒性可導(dǎo)致中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，最終誘發(fā)充血性心衰，在不影響交感活性前提下是較好的研究容量超負(fù)荷心衰的動(dòng)物模型。在我們的阿霉素誘導(dǎo)心衰小鼠模型中，心衰小鼠心臟NET mRNA 水平?jīng)]有變化，但蛋白表達(dá)量下降，表明心衰時(shí) NET 存在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)。這與既往研究的報(bào)道一致：在主動(dòng)脈縮窄術(shù)致充血性心衰的大鼠模型中，心臟 NET mRNA 表達(dá)不變，但心臟 NET再攝取功能受損，交感神經(jīng)末梢 NET 蛋白表達(dá)和活性降低[13]。心衰 時(shí) NET 存 在轉(zhuǎn)錄后蛋 白表達(dá) 的調(diào)控，這個(gè)調(diào)控可以是量的變化，也可以是細(xì)胞內(nèi)靶向定位的改變。mRNA 代表基因轉(zhuǎn)錄水平，蛋白代表翻譯水平，表示功能。從 mRNA 到翻譯成蛋白的過(guò)程會(huì)受到不同水平的調(diào)控，而且蛋白磷酸化等一系列轉(zhuǎn)錄后修飾過(guò)程可導(dǎo)致蛋白水平的差異，例如蛋白的降解，另外一種情況則是翻譯后的蛋白不能有效運(yùn)送至突觸前膜上。我們的研究結(jié)果表明，阿霉素誘導(dǎo)的充血性心衰小鼠心臟 NET蛋白表達(dá)下調(diào)，NE的合成限速酶TH蛋白表達(dá)顯著增加，表明心衰時(shí) NET再攝取功能障礙導(dǎo)致 NE 在心臟的儲(chǔ)備耗竭，NE 代償性合成增加。但 NET mRNA和交感神經(jīng)纖維密度沒(méi)有變化，β腎上腺素能受體未見(jiàn)明顯變化，提示在心衰早期即可出現(xiàn) NET的再攝取功能障礙。

NET是位于中樞和外周腎上腺素能神經(jīng)突觸前膜上的 Na+、Cl-依賴(lài)性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員之一，與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT）、5 羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、γ氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等具有高度同源性。NET 由 617個(gè)氨基酸組成，分子量 60～85 kDa[2]。80%～90% 的去甲腎上腺素由 NET再攝取，對(duì)于調(diào)控突觸間隙和腎上腺素能受體周?chē)?NE 濃度，終止 NE 作用，維持受體對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性起著至關(guān)重要的作用[1,2]。 交感 神 經(jīng)系 統(tǒng) 活性 調(diào) 節(jié)紊 亂 是心 血 管疾病 的重要病理機(jī)制之一。交感神經(jīng)支配的器官中，心臟NET的分布和 NE 再攝取的效率明顯高于其他如腎臟 和骨 骼肌等器官[1,2]。直 立性心動(dòng)過(guò) 速綜合征患者 存 在 NET 基 因 缺 陷，NE 再 攝 取 功 能障礙[14,15]。在人體和動(dòng)物研究中均已證實(shí)了 NET 表達(dá)和活性的 改變參與心衰的 發(fā)生發(fā)展[3-6]。心衰時(shí)心臟 NET介導(dǎo)的NE再攝取功能障礙，細(xì)胞外間隙長(zhǎng)期慢性持續(xù)性NE的蓄積導(dǎo)致腎上腺素能受體的過(guò)度激活，并 誘 導(dǎo)心 肌肥厚 和心 室重構(gòu)[16]。 而交 感 神經(jīng) 的過(guò)度激活和腎上腺素能受體的表達(dá)下調(diào)正是β腎上腺素能受體阻滯劑治療心衰的病理基礎(chǔ)，但β受體阻滯劑發(fā)揮療效需要數(shù)月的時(shí)間，對(duì) NET 表達(dá)和功能調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步研究有助于促進(jìn)心衰的診治進(jìn)展。研究顯示 NET表達(dá)和活性的降低發(fā)生在心 衰 早期[5]， 動(dòng)物實(shí) 驗(yàn) 證實(shí) 增 加 NET 的表 達(dá) 或改善其功能可以改善心室重構(gòu)和心功能：在心衰兔模型中利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)于心肌中過(guò)表達(dá) NET 可以增加 NE的再攝取，結(jié)果顯示左心室內(nèi)徑縮小，射血分 數(shù)增 加， 同時(shí)心肌 β 受體的 下調(diào) 被逆轉(zhuǎn)[17]；而在心衰大鼠星狀神經(jīng)節(jié)中注射神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以增加 NE 的再攝取，改善左心室功能[18]。心臟移植前患者經(jīng)左心室輔助裝置治療后心功能改善的同時(shí)伴隨 NET 蛋 白 表達(dá) 的 顯著 增 加[6]。小 劑 量卡 維 地洛在充血性心衰患者中使用1周，在不影響腎上腺素能受體的同時(shí)可以降低患者靜息和運(yùn)動(dòng)后的NE濃度，提示卡維地洛有可能可以改善 NET 的功能[19]。以上研究均證實(shí) NET 的表達(dá)和活性調(diào)控很有可能是心衰治療的新靶點(diǎn)。

基于以上研究基礎(chǔ)，我們證實(shí)在不影響交感興奮性的前提下，阿霉素誘導(dǎo)的充血性心衰小鼠心臟NET的表達(dá)下調(diào)，心衰早期即可發(fā)生 NE 再攝取功能的障礙，NE代償性合成增加，交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活形成惡性循環(huán)。NET的表達(dá)和調(diào)控在多種疾病包括精神、神經(jīng)系統(tǒng)及心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。對(duì) NET表達(dá)和功能的調(diào)控機(jī)制的進(jìn)一步探討有利于心衰的診治進(jìn)展。

[1]Eisenhofer G. The role of neuronal and extraneuronal plasma membrane transporters in the inactivation of peripheral catecholamines. Pharmacol Ther, 2001, 91: 35-62.

[2]Schroeder C, Jordan J. Norepinephrine transporter function and human cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 303: H1273-1282.

[3]Liang CS, Fan TH, Sullebarger JT, et al. Decreased adrenergic neuronal uptake activity in experimental right heart failure. A chamber-specific contributor to beta-adrenoceptor downregulation. J Clin Invest, 1989, 84: 1267-1275.

[4]B?hm M, La Rosée K, Schwinger RH, et al. Evidence for reduction of norepinephrine uptake sites in the failing human heart. J Am Coll Cardiol, 1995, 25: 146-153.

[5]Kawai H, Mohan A, Hagen J, et al. Alterations in cardiac adrenergic terminal function and beta-adrenoceptor density in pacing-induced heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278: H1708-1716.

[6]Haider N, Baliga RR, Chandrashekhar Y, et al. Adrenergic excess, hNET1 down-regulation, and compromised mIBG uptake in heart failure poverty in the presence of plenty. JACC Cardiovasc Imaging, 2010, 3: 71-75.

[7]Teraoka K, Hirano M, Yamaguchi K, et al. Progressive cardiac dysfunction in adriamycin-induced cardiomyopathy rats. Eur J Heart Fail, 2000, 2:373-378.

[8]Li H, Ma SK, Hu XP, et al. Norepinephrine transporter (NET) is expressed in cardiac sympathetic ganglia of adult rat. Cell Res, 2001, 11: 317-320.

[9]Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem， 1985， 150: 76-85.

[10]Goldner J. A modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. Am J Pathol，1938， 14: 237-243.

[11]張健 . β 受體阻滯劑在心力衰竭治療中的應(yīng)用 . 中國(guó)循環(huán)雜志，2009， 24: 391-393.

[12]李為民 , 張曉偉 . 2012 年歐洲心臟病學(xué)會(huì)急慢性心力衰竭指南解讀 . 中國(guó)循環(huán)雜志，2012， 27: 33-38.

[13]Backs J, Haunstetter A, Gerber SH, et al. The neuronal norepinephrine transporter in experimental heart failure: evidence for a posttranscriptional downregulation. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33: 461-472.

[14]Bayles R, Harikrishnan KN, Lambert E, et al. Epigenetic modification of the norepinephrine transporter gene in postural tachycardia syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32: 1910-1916.

[15]Lambert E, Eikelis N, Esler M, et al. Altered sympathetic nervous reactivity and norepinephrine transporter expression in patients with postural tachycardia syndrome. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2008, 1: 103-109.

[16]Liang CS. Cardiac sympathetic nerve terminal function in congestive heart failure. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28: 921-927.

[17]Münch G, Rosport K, Bltmann A, et al. Cardiac overexpression of the norepinephrine transporter uptake-1 results in marked improvement of heart failure. Circ Res, 2005, 97: 928-936.

[18]Kreusser MM, Haass M, Buss SJ, et al. Injection of nerve growth factor into stellate ganglia improves norepinephrine reuptake into failing hearts. Hypertension, 2006, 47: 209-215.

[19]Machida M, Takechi S, Fujimoto T, et al. Carvedilol improves uptake-1 in patients with systolic congestive heart failure. J Cardiovasc Pharmacol, 2012, 59: 175-181.

Protein Expression Changes of Norepinephrine Transporter in Adriamycin Induced Congestive Heart Failure Mice model

JIN Wen-ying, QIAO Zheng-guo, ZHENG Chun-hua, LI Su-fang, CHEN Hong.
Department of Cardiology, Peking University People’s Hospital, Beijing (100044), China

CHEN Hong, Email: chenhong0418@yahoo.com.cn

Objective: To observe the protein expression changes of norepinephrine transporter (NET) in adriamycin induced congestive heart failure (CHF) mice model.Methods: The adriamycin induced CHF mice model was established, the heart tissue and middle cervical-stellate ganglion complex (MC-SGC) were isolated. The mRNA expression of NET and adrenergic receptor (β1-AR) was detected by RT-PCR, the protein expression of NET and tyrosine hydroxylase (TH) was measured by Western blot analysis, and the cardiac sympathetic nerve fibers were examined with immunohistochemistry.Results: ① The mRNA expression of NET and β1-AR was unchanged in stellate ganglion in CHF mice. ② The protein expression was decreased in NET and increased in TH. ③ The density of sympathetic nerve fibers were unchanged in the early stage of CHF in mice model.Conclusion: The protein expression of NET was down-regulated and the unbalanced activity of sympathetic nerve may worsen the cardiac function in CHF mice model.

Norepinephrine transporter; Adriamycin; Congestive heart failure; Sympathetic nerve

2013- 06-03）

（編輯：汪碧蓉）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.31000472）

100044 北京市， 北京大學(xué)人民醫(yī)院 心臟中心

靳文英 主治醫(yī)師 博士 從事心血管疾病的基礎(chǔ)和臨床研究 Email：jjwyy@sina.com 通訊作者：陳紅 Email： chenhong0418@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614（2013）06-0458 -05

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.06.015

方法： 建立阿霉素誘導(dǎo)的充血性心衰小鼠動(dòng)物模型，分離小鼠心臟和頸交感神經(jīng)節(jié)，實(shí)時(shí)熒光定量多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）的方法檢測(cè) NET 和腎上腺素能受體 β1-AR 的 mRNA 表達(dá)，用 Western blot方法檢測(cè) NET 和酪氨酸羥化酶（TH）的蛋白表達(dá)。免疫組化方法染色心臟交感神經(jīng)纖維。

結(jié)果：①心衰小鼠心臟交感神經(jīng)節(jié)中 NET 和 β1-AR 的 mRNA 表達(dá)無(wú)明顯變化。②心衰小鼠心肌組織中 NET 的蛋白表達(dá)顯著降低，而TH的蛋白表達(dá)上調(diào)。③心衰早期小鼠心肌交感神經(jīng)纖維密度無(wú)明顯變化。

結(jié)論： 充血性心衰小鼠心臟 NET 的蛋白表達(dá)存在轉(zhuǎn)錄后的下調(diào)，心衰早期 NET 的表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致 NE 再攝取障礙，交感神經(jīng)活性失衡從而加劇心功能的惡化。