崔偉曦，楊 杰，陳筱清，毛 茜，聞曉東，王 強*

(1.中國藥科大學 中藥學院中藥分析教研室，江蘇 南京210009;2.首都醫(yī)科大學 中藥學院，北京100069)

山綠茶為冬青科冬青屬植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的干燥葉，主產于廣西、海南等地，全年可采，資源豐富，具有悠久的民間藥用歷史，多泡茶飲，具有清熱解毒，消腫止痛，活血通脈的功效，主要用于降血壓，降血脂，降膽固醇，冠心病，腦血管意外所致的偏癱等疾?。?］。本實驗室前期研究表明，山綠茶對高脂飼料誘導的大鼠非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease，NAFLD)療效顯著，但其有效部位和活性成分尚不明確?；瘜W研究表明，山綠茶中富含酚酸和黃酮類成分［2-3］，故本文對山綠茶中總酚酸和總黃酮兩個有效部位抗大鼠非酒精性脂肪肝的藥效作用進行了研究，以期對山綠茶資源的開發(fā)與有效利用及藥效學研究提供依據。

1 材 料

1.1 植物來源

山綠茶采自廣西，由中國藥科大學王強教授鑒定為冬青科冬青屬植物海南冬青(Ilex hainanensis Merr.)的葉，標本(No.20080201)存放于中國藥科大學中藥分析教研室。

1.2 主要試劑與儀器

甘油三酯(TG)試劑盒，總膽固醇(TC)試劑盒，低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)試劑盒，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)試劑盒，血漿谷丙轉氨酶(ALT)測定試劑盒，血漿谷草轉氨酶(AST)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;乙腈和甲酸購自Merck 公司(色譜純，Merck，Darmstadt，Germany);其它試劑均為分析純。

紫外- 可見分光光度計(UV - 2501PC，Shimadzu);高效液相色譜儀(Agilent 1100 Series)、DAD檢測器、Agilent ChemStation 色譜工作站;色譜柱(Kromasil，4.6 ×150 mm);酶標儀(Epoch，BioTek，USA);勻漿機(IKA，T10 basic Ultra - TURRAX，Germany)。

1.3 動物及飼料

清潔級雄性SD 大鼠(120 ～150 g)，由江蘇大學實驗動物中心提供(許可證號SCXK(蘇)2000 -0002)。

高脂飼料配方 基礎飼料858 g/kg，豬油100 g/kg，膽固醇10 g/kg，膽酸鈉2 g/kg，蔗糖30 g/kg;普通飼料及高脂飼料均由江蘇省南京市青龍山動物繁殖廠提供。

2 方 法

2.1 山綠茶總酚酸和總黃酮的制備

取山綠茶藥材5 kg，以80 %乙醇溶液浸泡過夜，加熱回流提取2 次，每次2 h。提取液減壓回收溶劑，濃縮得稠浸膏，以4 000 r·min-1離心10 min，分離得到上清液和沉淀部分。上清液經HPD -400大孔樹脂吸附分離，先以水洗脫3 倍柱體積，棄去，再分別以10%、30%和50%乙醇洗脫，合并10%和30%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮得浸膏，自然晾干，粉碎，過60 目篩，得到山綠茶總酚酸有效部位，得率1.62%;取50%乙醇洗脫液，減壓回收溶劑，濃縮得浸膏，自然晾干，粉碎，過60 目篩，得到山綠茶總黃酮有效部位，得率1.52%。實驗時，一定量總酚酸和總黃酮粉末用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)制成混懸溶液用于給藥。

2.2 山綠茶總酚酸和總黃酮的測定

2.2.1 山綠茶總酚酸的測定

精確稱取總酚酸粉末約4 mg，置棕色量瓶中，精密加入50%乙醇20 mL，稱重，超聲提取30 min，用50%乙醇補足原重，過濾，續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，置于25 mL 棕色量瓶中，加50%乙醇至5 mL，再分別精密加入0.3%十二烷基硫酸鈉硫酸鈉溶液2 mL 和0.5%鐵氰化鉀-1%三氯化鐵(1∶1)混合溶液1 mL，搖勻，暗處放置5 min，加0.1 moL/L 鹽酸溶液至25 mL，搖勻，暗處放置20 min，在729 nm 波長處測定吸收值。以綠原酸為對照品，制備標準曲線，得回歸方程，計算總酚酸含量。

2.2.2 山綠茶總黃酮的測定

精密稱總黃酮粉末約10 mg，置錐形瓶中，加入20 mL 甲醇，稱重，超聲提取30 min，用甲醇補足原重，過濾，取續(xù)濾液即為供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇至3 mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉試液4 mL，在再加甲醇至刻度，搖勻，放置15 min，在500.5 nm 波長處測定吸收值。以蘆丁為對照品，制備標準曲線，得回歸方程，計算總黃酮含量。

2.3 總酚酸和總黃酮中主要成分含量測定

2.3.1 總酚酸中綠原酸的含量測定

取總酚酸粉末約2 mg，精密稱定，置1 mL 棕色量瓶中，精密加入甲醇0.8 mL，超聲處理30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。在下述色譜條件下，以綠原酸為對照品，標準曲線法進行檢測定量。色譜條件:色譜柱:Kromasil C18 柱(4.6 mm×150 mm);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min。流動相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;進樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表1;檢測波長:326 nm。

表1 總酚酸中綠原酸測定梯度洗脫程序

2.3.2 總黃酮中蘆丁和華中冬青黃酮-7 -O -β-D-吡喃葡萄糖苷的含量測定

精密稱取總黃酮粉末約2 mg，置于1 mL 量瓶中，精密加入0.8 mL 甲醇，超聲30 min，放冷，甲醇定容至1 mL，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。在下述色譜條件下，以蘆丁和華中冬青黃酮-7 -O -β -D -吡喃葡萄糖苷制備混合對照品，標準曲線法進行檢測定量。色譜條件:色譜柱:Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm);柱溫:25 ℃;流速:1 mL/min。流動相:A:0.1%甲酸-水，B:0.1%乙腈;進樣量:10 μL。梯度洗脫程序見表2;檢測波長:256 nm、285 nm。

表2 總黃酮中蘆丁和華中冬青黃酮測定梯度洗脫程序

2.4 大鼠非酒精性脂肪肝模型的建立

34 只雄性SD 大鼠適應性飼養(yǎng)1 周之后，隨機分為正常組(n=11)和模型組(n=23)，正常組大鼠給以普通飼料，模型組大鼠給以高脂飼料。飼養(yǎng)室內溫度控制在20 ±2 ℃，相對濕度60% ～70%，明暗各12 h，自由飲水、進食。3 周后，隔夜禁食12 h，眼眶靜脈取血，分離血漿，測定各大鼠血漿甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL -c)、谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)。另外，隨機抽取各組5 只大鼠，脫頸椎處死，分離肝臟并稱重，計算肝指數(肝濕重/大鼠體重×100%)，并取肝臟相同部位用4%中性多聚甲醛固定，進行肝臟病理學檢查。測定結果(表3)顯示，與正常組相比，模型組大鼠體重和肝指數均顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血漿TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也較正常組明顯升高(P ＜0.01)，HDL-c 較正常組降低(P ＜0.01);H＆E 染色結果顯示(圖1A 和B)，正常組大鼠肝臟肝小葉結構清晰，肝細胞排列呈索狀，肝竇無擴張充血，未見明顯的脂肪變性;模型組大鼠肝臟肝小葉結構尚可見，但部分肝細胞體積變大變圓、胞漿內有許多小的脂肪空泡或融合成較大的脂滴，肝竇受壓變窄，出現明顯的脂肪變性，由此表明，NAFLD 模型建立成功。

2.5 給藥方法

造模成功后，模型組大鼠隨機分為模型對照組(n=6)、酚酸給藥組(n=6)和黃酮給藥組(n =6)。以上3 組大鼠給以高脂飼料，正常組大鼠(n =6)給以普通飼料，所有大鼠均自由進食和飲水。此外，酚酸給藥組灌胃給以105 mg/(kg·d)總黃酮-0.5%CMC-Na 混懸液，黃酮給藥組給以100 mg/(kg·d)總酚酸-0.5%CMC -Na 混懸液，即相當于生藥量6.5 g/(kg·d);正常組和模型對照組給以10 mL/(kg·d)0.5%CMC-Na。給藥周期為2 周。

2.6 肝指數和血液指標的檢測

給藥2 周后，大鼠隔夜禁食12 h，稱量體重，眼眶靜脈取血，分離血漿，并分離出肝臟，預冷生理鹽水洗凈，吸水紙吸干，稱取肝臟濕重，計算肝指數。

血漿TG、TC、LDL -c、HDL -c、ALT 和AST 的含量按照相應試劑盒的說明書進行測定。

2.7 肝臟中TG 和TC 的測定

剪取相同部位肝組織，用無水乙醇制成10%肝勻漿(肝組織重量∶無水乙醇體積=1∶9)。肝組織中TG 和TC 含量按照相應試劑盒的說明書進行測定。

2.8 肝臟病理學檢查

取相同部位肝組織，4%中性多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，制片(4μm 厚)，蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin，HE)染色，由病理專業(yè)人員在光學顯微鏡下閱片，觀察組織的病理學改變，并按照肝細胞脂肪變的程度進行評分(計分:0，無;計分:1，＜1/4;計分:2，1/4 ～1/2;計分:3，1/2 ～3/4;計分:4，＞3/4)［4-5］。

2.9 統(tǒng)計學處理

采用SPSS11.5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以± SEM 表示。P ＜0. 05 為有統(tǒng)計學差異，P ＜0.01 為有顯著統(tǒng)計學差異。

3 結 果

3.1 山綠茶總酚酸和總酚酸及其主要成分的含量

紫外-可見分光光度法結果顯示，總酚酸的含量為78.33% ±0.29%，總黃酮的含量為75.32% ±0.35%。高效液相法結果顯示，山綠茶總酚酸中綠原酸的含量為3.70% ±0.12%;總黃酮中蘆丁的含量為1.27% ±0.05%，華中冬青黃酮-7 -O -β -D-吡喃葡萄糖苷的含量為1.78% ±0.03%。

3.2 各組大鼠體重、肝指數及血液指標的變化

各組大鼠體重、肝指數及各血液指標的結果見表3。喂食5 周后，模型組大鼠體重和肝指數均較正常組顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)，血漿TG、TC、LDL-c、ALT 和AST 也較正常組明顯升高(P ＜0.05 或P ＜0. 01)，HDL - c 較正常組降低(P ＜0.01)。與模型組相比，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠體重和肝重均有降低的趨勢，酚酸給藥組大鼠體重和肝重分別較模型組降低3.72%和9.57%，黃酮給藥組降低8.09%和12.57%，但未呈現顯著性差異(P ＞0.05);酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠肝指數分別較模型組降低6.44%和5.71%，且存在顯著性差異(P ＜0.05);血脂各項指標的檢測結果顯示，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠血漿TG、TC 和LDL-c 分別較模型組降低41.58%和35.70%(P ＜0.05)、37.44%和33.60%(P ＜0.05)、43.09%(P＜0.05)和64.43%(P ＜0.01)，HDL -c 分別較模型組升高32.65%和22.45%(P ＜0.05);轉氨酶檢測結果顯示，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠血漿ALT 分別較模型組降低33. 20% (P ＜0. 01)和21.50%(P ＜0. 05)、AST 分 別 較 模 型 組 降 低27.75%(P ＜0.01)和14.30%(P ＜0.05)。由以上結果可以看出，總黃酮在降低NAFLD 大鼠體重和肝重方面略優(yōu)于總酚酸;而總酚酸在改善血脂和轉氨酶方面略優(yōu)于總黃酮，但差異并不顯著，提示山綠茶抗NAFLD 是通過多種成分共同作用實現的。

表3 各組大鼠體重、肝指數及各血液指標的比較

3.3 各組大鼠肝組織中TG 和TC 的含量變化

各組大鼠肝脂質TG、TC 含量見表4。與正常組相比，模型組大鼠10%肝組織勻漿中TG 和TC 含量均顯著升高(P ＜0.01)。酚酸給藥組大鼠肝勻漿中TG 含量較模型組降低5.72%，但兩組間不存在顯著性差異，TC 含量較模型組降低18.55%(P ＜0.01);黃酮給藥組大鼠肝勻漿中TG 和TC 含量分別較模型組降低20.71%和26.62%(P ＜0.01)，在降低NAFLD 大鼠肝脂質含量方面略優(yōu)于酚酸組。

表4 各組大鼠肝臟中甘油三酯和膽固醇的含量

3.4 各組大鼠肝臟組織形態(tài)學變化

光鏡下觀察各組大鼠肝組織HE 染色切片，結果如圖1 所示，3 周時正常組大鼠肝組織肝小葉結構清晰，肝細胞排列呈索狀，肝竇無擴張充血，未見明顯的脂肪變性(圖1A);模型組大鼠肝組織肝小葉結構尚可見，但部分肝細胞體積變大變圓、胞漿內有許多小的脂肪空泡或融合成較大的脂滴，肝竇受壓變窄，出現明顯的脂肪變性(圖1B)。5 周時正常組大鼠肝組織形態(tài)基本與3 周時相同，未見異常病理變化(圖1C);模型組大鼠肝組織脂變程度較3 周時明顯加重，呈彌漫性脂肪變性(圖1D);酚酸給藥組大鼠(圖1E)和黃酮給藥組大鼠(圖1F)肝組織脂肪變性程度均明顯減輕，脂變積分如圖1G 所示，與模型組相比，酚酸給藥組和黃酮給藥組大鼠肝組織脂變積分均顯著降低(分別為P ＜0. 05 和P ＜0.01)，黃酮的改善效果略優(yōu)于酚酸，但2 組的脂變積分之間不存在顯著性差異。

圖1 肝組織病理切片(HE 染色，×200)

4 結 論

山綠茶總黃酮在降低非酒精性脂肪肝大鼠體重、肝重，肝脂質TG 和TC 含量以及改善肝臟組織形態(tài)和脂肪變性方面略優(yōu)于總酚酸;而總酚酸在改善血脂和轉氨酶方面略優(yōu)于總黃酮，但兩有效部位抗非酒精性脂肪肝藥效作用差異并不顯著，提示山綠茶抗非酒精性脂肪肝是通過多種成分共同作用實現的。

山綠茶為常綠植物，其葉四季均可采，資源豐富。目前山綠茶主要作為生產山綠茶降壓制劑的原料藥材，療效顯著，此外，藥理研究表明，山綠茶對于高血脂癥也具有較好的防治作用［6］，本實驗研究結果表明，山綠茶總酚酸和總黃酮對非酒精性脂肪肝也有較好的治療作用。鑒于其較高的藥用價值及豐富的資源，山綠茶值得進一步開發(fā)利用。

［1］ 廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳. 廣西中藥材標準:1990 年版［S］. 南寧:廣西科學技術出版社，1992.

［2］ Chen X Q，Zan K，Yang J，Lai M X，et al. A novel flavanone from Ilex hainanensis Merr. ［J］. Natural Product Research，2009，23(5):442 -447.

［3］ 陳勇，李耀華，謝臻，等.山綠茶不同炮制品中綠原酸的含量比較［J］.中藥材，2005，28(2):107 -109.

［4］ Dixon J B，Bhathal P S，Hughes N R，et al. Nonalcoholic fatty liver disease:improvement in liver histological analysis with weight loss［J］. Hepatology，2004，39:1647 -1654.

［5］ Kirsch R，Clarkson V，Shephard EG，et al. Rodent nutritional model of non - alcoholic steatohepatitis:species，strain and sex difference studies ［J］. Journal of Gastroenterology Hepatology，2003，18:1272 -1282.

［6］ 方如塘，魏堂昇.山綠茶醇提物對大鼠實驗性高脂血癥防治作用的研究［J］.西北藥學雜志，2011，26(2):123 -125.