齊向英，陳宗禮，薛 皓，劉航娟，行文珍，謝 路

［陜西省紅棗重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(延安大學(xué))，延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安716000］

棗(Ziziphus jujube Mill.)屬于鼠李科(Rham naceae)棗屬(Ziziphus Mill.)植物。紅棗素有“天然維生素丸”之美稱，其所含的維生素不僅種類多，而且含量高。鮮棗維生素C 的含量是蘋果的75 倍，桃子的80 ～100 倍［1］。狗頭棗果實(shí)卵圓形或錐形，似狗頭狀，有“棗中狀元”的美名。這不只是因?yàn)樗姆N植效益好，關(guān)鍵是狗頭棗的維生素、粗纖維、磷、鐵等多種微量素的含量居各類紅棗之首［2］。陜北地區(qū)盛產(chǎn)的狗頭棗，其果實(shí)大、品質(zhì)好、為優(yōu)良鮮食制干兼用棗品種，平均單果重18.79 g，果實(shí)較整齊，外形美觀，果皮中厚，褐紅色，果肉細(xì)脆、葉液中多，味酸甜，適宜鮮食和制干。近年來狗頭棗的研究報(bào)道逐漸增多，這些報(bào)道集中狗頭棗的形態(tài)解剖學(xué)研究、組培快繁、多倍體育種等方面。但有關(guān)狗頭棗原生質(zhì)體分離至今未見報(bào)道。本文研究的目的是通過正交設(shè)計(jì)探索狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的最佳酶液濃度和甘露醇濃度，為狗頭棗葉片原生質(zhì)分離提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用材料為按陳宗禮［3］等方法培養(yǎng)25 d 狗頭棗組培苗。

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):按三因素四水平設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，分別設(shè)計(jì)纖維素酶(sigma)0.1 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L、1.0 g/L 四個(gè)濃度水平;果膠酶(sigma)0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 四個(gè)濃度水平;甘露醇0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 四個(gè)濃度水平;共16 個(gè)組合［4］。

原生質(zhì)體分離:在超凈工作臺(tái)中，取培養(yǎng)好的狗頭棗試管苗葉片，剪取頂端完全展開的5 片葉子。稱重后，將葉片剪成1 ～2 mm 的細(xì)條狀放入經(jīng)過濾滅菌后的混合酶液中，使材料和酶液的體積比為1∶10。在(25 ±2)℃、50 r/min 的搖床上、黑暗的條件下震蕩酶解。每隔2 h 取酶解液觀察并統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)量，直至原生質(zhì)數(shù)量不在增加，確定最佳酶解時(shí)間。

原生質(zhì)數(shù)量測定:使用血球計(jì)數(shù)板對原生質(zhì)體產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)

原生質(zhì)體數(shù)(個(gè)/mL)= 5 個(gè)大格內(nèi)總原生質(zhì)體數(shù)×5 ×1 000 ×原生質(zhì)體稀釋倍數(shù)。每個(gè)樣處理平均計(jì)數(shù)測定3 次以上，最后取其平均值。

原生質(zhì)產(chǎn)量=原生質(zhì)體數(shù)(個(gè)/mL)×稀釋后體積(mL)÷懸浮細(xì)胞總質(zhì)量(g)

原生質(zhì)體活力測定:FDA 熒光染色法。

原生質(zhì)體活力 =(被染上色的原生質(zhì)體數(shù)÷觀察到的原生質(zhì)體總數(shù))×100%

活原生質(zhì)體產(chǎn)量=原生質(zhì)體產(chǎn)量×原生質(zhì)體活力

2 結(jié)果與分析

在狗頭棗葉片酶解過程中，從酶解開始的第2 h開始，每隔2 h 吸取酶解混合液并進(jìn)行原生質(zhì)體純化。將純化后的原生質(zhì)體，在血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算其原生質(zhì)體產(chǎn)量，直到原生質(zhì)體的數(shù)目比前一次記錄的個(gè)數(shù)不再增加時(shí)，停止酶解。從實(shí)驗(yàn)記錄的結(jié)果中，我們發(fā)現(xiàn)在狗頭棗葉片酶解過程進(jìn)行到8 h，獲得的原生質(zhì)體數(shù)目比較多，活原生質(zhì)體數(shù)量也比較大，分離效果比較理想，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。

2.1 不同組合對狗頭棗葉片原生質(zhì)分離的影響

在不同酶液濃度和甘露醇濃度組合中，F(xiàn)15 的組合纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.4 g/L、甘露醇0.6 mol/L 分離的效果最好，原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到2.12×106個(gè)/g，活原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到1.72 ×106個(gè)/g，成活率達(dá)到80.88%。其次為F16 纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.5 g/L、甘露醇0.5 mol/L，原生質(zhì)體的產(chǎn)量為1.69 ×106個(gè)/g，活原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到1.03 ×106個(gè)/g，成活率達(dá)到61.121%。原生質(zhì)體產(chǎn)量最低的組合為F14 纖維素酶1.0 g/L、果膠酶0.3 g/L、甘露醇0.7 mol/L，原生質(zhì)體的產(chǎn)量為0.7 ×106個(gè)/g，活原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到0.53 ×106個(gè)/g。

2.2 酶液濃度對分離原生質(zhì)體的影響

由統(tǒng)計(jì)結(jié)果表可知纖維素酶含量對狗頭棗葉片原生質(zhì)分離的效果為k4＞k3＞k2＞k1。在纖維素酶含量分別為0.1 g/L、0.25 g/L、0. 5 g/L、1. 0 g/L時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量的平均數(shù)分別為0.665 ×106個(gè)/g、1.187 5 × 106個(gè)/g、1. 22 × 106個(gè)/g、1.507 5 × 106個(gè)/g;活原生質(zhì)產(chǎn)量的平均數(shù)分別為0.175 ×106個(gè)/g、0.22 ×106個(gè)/g、0.235 ×106個(gè)/g、0.75 ×106個(gè)/g。說明在狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離過程中需要纖維素酶的含量較多。當(dāng)纖維素酶濃度為1.0 g/L 時(shí)，狗頭棗葉片原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性都比較大。極差分析顯示纖維素酶對狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的效果差值為0.765，對活原生質(zhì)獲得的效果差值為0.43。

果膠酶含量對狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的效果為k4＞k3＞k1＞k2。在果膠酶濃度分別為0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L 時(shí)，原生體1.032 5 ×106個(gè)/g、0.775 ×106個(gè)/g、1.232 5 ×106個(gè)/g、1. 54 ×106個(gè)/g;活原生質(zhì)產(chǎn)量的平均數(shù)分別為0.172 5 ×106個(gè)/g、0.15 ×106個(gè)/g、0.58 ×106個(gè)/g、0.415 ×106個(gè)/g。當(dāng)果膠酶濃度為0.4 g/L，獲得的原生質(zhì)體數(shù)量和活原生質(zhì)體的產(chǎn)量較大。極差分析顯示果膠酶對狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的效果差值為0.842 5，對活原生質(zhì)獲得的效果差值為0.575。

2.3 滲透壓濃度對分離原生質(zhì)體的影響

甘露醇濃度對狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的效果為k2＞k1＞k4＞k3。在甘露醇濃度分別為0.5 mol/L、0.6 mol/L、0.7 mol/L、0.8 mol/L 時(shí)，狗頭棗葉片原生質(zhì)產(chǎn)量的平均數(shù)分別為1.16 ×106個(gè)/g、1.325×106個(gè)/g、0.99 ×106個(gè)/g、1.105 ×106個(gè)/g，或原生質(zhì)體產(chǎn)量的平均數(shù)分別為0.455 ×106個(gè)/g、0.54 ×106個(gè)/g、0.235 ×106個(gè)/g、0.15 ×106個(gè)/g。當(dāng)甘露醇濃度為0.6 mol/L 時(shí)，對狗頭棗葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量和活原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響較大。極差分析顯示甘露醇濃度對狗頭棗葉片原生質(zhì)體分離的效果差值為0.335，對活原生質(zhì)獲得的效果差值為0.39。

由以上結(jié)果可以看出，在用纖維素酶、果膠酶和甘露醇的混合液來分離狗頭棗葉片原生質(zhì)體的過程中分離的主次因素分別為A 因素(纖維素酶)、B 因素(果膠酶)、C 因素(甘露醇)。由此得到原生質(zhì)獲得量的組合為A4B4C2;獲得活原生質(zhì)體獲得率的組合為A4B3C2。材料和酶液的比例為1∶10。酶解時(shí)間為8 h。本研究中的F15 原生質(zhì)體的產(chǎn)量達(dá)到2.12 ×106個(gè)/g，活原生質(zhì)體數(shù)達(dá)到1.72 ×106個(gè)/g，成活率達(dá)到80.88%，恰好是活原生質(zhì)體獲得率的組合A4B3C2。所以我們認(rèn)為適合狗頭棗葉片原生體分離的最佳組合為A4B3C2。

表1 不同酶液組合對原生質(zhì)體分離的影響

3 討 論

原生質(zhì)體是植物除去細(xì)胞壁后，具有活性的最小單位［5］，植物細(xì)胞壁的主要成分是纖維素和果膠。植物原生質(zhì)分離的過程主要就是除去這兩種物質(zhì)。分離中常用到的酶為纖維素酶和果膠酶，酶液通常需要保持較高的滲透壓［6］，以便使原生質(zhì)體在分離前細(xì)胞處于質(zhì)壁分離狀態(tài)，分離后不致膨脹破裂，常用的滲透壓穩(wěn)定劑為甘露醇等。本文的研究也采用了纖維素酶、果膠酶和甘露醇來完成。

我國從1974 年以來許多單位也相繼開展這方面的研究工作［7］。何業(yè)華［8］等用棗樹胚性懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)粒狀胚性愈傷組織、未細(xì)切愈傷組織和已細(xì)切愈傷組織4 種材料做了原生質(zhì)體分離研究，發(fā)現(xiàn)用濃度為10 g/L 纖維素酶+1 g/L 離析酶+CPW鹽+0.7 mol/L 甘露醇組成的混合酶液對起始材料進(jìn)行16 h 的酶解，可獲得較高的原生質(zhì)體產(chǎn)量，且原生質(zhì)體活力較高。劉曉光等［7］用冬棗花藥愈傷組織懸浮系做了原生質(zhì)體分離研究發(fā)現(xiàn)用0.6 mol/L 甘露醇+0.1%MES+20 ～25 g/L 纖維素酶，酶解16 h得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力較高。趙維峰［9］等研究了毛葉棗和冬棗愈傷組織的原生質(zhì)體分離條件發(fā)現(xiàn)毛葉棗酶解所需酶液濃度為纖維素酶10 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L;冬棗酶解所需酶液濃度為纖維素酶15 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L，酶解時(shí)間均為14 ～16 h。邢東方［10］以繼代20 d 左右的灰棗試管苗頂梢3 片完全展開的嫩葉為分離材料在2.0% Cellulase R -10 +0.1%MacerozymeR-10 +0.1% Pectolase Y -23 +0.4 %Driselase 酶液中獲得了原生質(zhì)體，產(chǎn)量為1.1 ×107個(gè)/g·FW，活性為85.7%，并發(fā)現(xiàn)4 種酶中，對原生質(zhì)體分離影響大小順序?yàn)镈riselase ＞CellulaseR -10 ＞MacerozymeR -10 ＞Pectolase Y -23，Driselase對原生質(zhì)體的分離起首要作用。牛瑜菲［11］研究了酸棗花粉四分體時(shí)期原生質(zhì)體分的酶液組合發(fā)現(xiàn)用蝸牛酶1.0% +纖維素酶0.5% +甘露醇0.3 mol/L+0.1% MES，酶解4 h 效果最佳，同時(shí)在酸棗葉片愈傷組織懸浮細(xì)胞系原生質(zhì)體分離時(shí)的酶液濃度為纖維素酶10 g/L+離析酶5 g/L+甘露醇0.7 mol/L+0.1% MES，酶解時(shí)間16 h。趙維峰［12］用毛葉棗做研究，發(fā)現(xiàn)組培苗葉片分離出具有活性的原生質(zhì)體能力優(yōu)于愈傷組織的懸浮系，其中毛葉棗所需酶液濃度為纖維素酶10 g/L +離析酶4 g/L +甘露醇0.7 mol/L;冬棗所需酶液濃度為纖維素酶15 g/L+離析酶4 g/L+甘露醇0.7 mol/L。

本文的研究結(jié)果和上述研究存在一定差異的原因可能是所用的材料具有個(gè)體差異。本實(shí)驗(yàn)只對狗頭棗組培苗葉片原生質(zhì)體分離過程中纖維素酶、果膠酶、甘露醇濃度組合進(jìn)行了探討。至于其它的組織或因素是否會(huì)對其原生質(zhì)分離效果存在影響還需進(jìn)一步的研究。

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