金 軼

維生素K(vitamin K)是一類具有萘醌基團(2-甲基-1，4萘醌)的衍生物，在傳統(tǒng)醫(yī)學臨床實踐中，人們通過測定依賴維生素K的凝血因子或凝血酶原時間、部分凝血活酶時間、凝血試驗等評價機體凝血功能狀態(tài)的指標來反映維生素K的營養(yǎng)狀況。但這些均為功能性指標，揭示臨床水平的維生素K是否缺乏，一旦維生素K缺乏，則表明機體維生素K缺乏已達到嚴重程度?；谶@些原因，通過“評價機體凝血功能狀況”來反映維生素K營養(yǎng)狀況的方法正逐步由“評估機體維生素K營養(yǎng)狀況”所取代[1]。伴隨著凝血酶原前體蛋白、骨鈣蛋白(OC)等維生素K依賴蛋白的發(fā)現(xiàn)以及高效液相色譜檢測技術(shù)的發(fā)展，逐步弄清了維生素K發(fā)揮生理作用的本質(zhì)，使從生化水平了解機體維生素K營養(yǎng)狀況成為可能。本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定不同年齡組兒童血未羧化骨鈣蛋白(UOC)和OC水平，計算出OC的未羧化率，并以此來揭示機體維生素K營養(yǎng)狀況，以便預(yù)防因維生素K缺乏對小兒骨代謝造成的影響，為臨床醫(yī)生如何補充及應(yīng)用維生素K提供了更好的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機抽取2012年1—5月于我院兒科首診的0～14歲健康小兒62例，均無血液系統(tǒng)、肝臟系統(tǒng)疾病；未服用過影響維生素K代謝的藥物，如雙香豆素類抗凝劑、抗癲癇藥、抗結(jié)核藥、抗生素、阿司匹林等。按照年齡，將其分為5組：0～3個月為A組(13例)，>3個月～1歲為B組(9例)，>1～3歲為C組(13例)，>3～9歲為D組(14例)，>9～14歲為E組(13例)。

1.2 儀器及試劑盒 (1)儀器：全自動酶標儀(Wellscan MK3，芬蘭)，全自動洗板機(DEM-Ⅱ型，北京)。(2)試劑盒：OC試劑盒為美國DSL公司的OC酶聯(lián)免疫測定盒；UOC試劑盒為日本TakaRa公司的UOC酶聯(lián)免疫測定盒(Glu-OC EIA Kit)。

1.3 方法

1.3.1 標本采集 所有小兒在上午8：00～9：00采集清晨空腹靜脈血4 ml，不抗凝，待血液充分凝固后，于3 000 r/min離心5 min，分別留取血清，置-20 ℃冰箱保存待測。

1.3.2 操作步驟

1.3.2.1 OC的測定步驟 將待測標本置室溫下復(fù)溫、溶化、稀釋，用辣根過氧化物酶標記的抗OC多克隆檢測抗體孵育，孵育、洗板后用四甲基對二氨聯(lián)苯(TMB)使之顯色，酶作用物的酶轉(zhuǎn)化程度用450 nm和620 nm處的雙波長吸光度來測定。吸光度值與血清OC水平呈正相關(guān)。根據(jù)吸光度與OC水平的標準曲線，可以計算出未知標本的OC水平。

1.3.2.2 UOC的測定步驟 將待測標本置室溫下復(fù)溫、溶化，將標本、標準品滴定于覆被有鼠抗UOC的多克隆抗體的孔中孵育、洗板后，加入標記有過氧化物酶的二抗。孵育洗板后，加入TMB使之顯色。酶作用物的酶轉(zhuǎn)化程度用450 nm處的波長吸光度來測定。吸光度值與血清UOC水平呈正比。繪制吸光度與UOC水平的標準曲線，計算出未知標本的UOC水平。OC未羧化率(%)=UOC/OC×100%。

2 結(jié)果

2.1 各年齡組小兒UOC、OC及OC未羧化率比較 各年齡組小兒血清UOC、OC水平及OC未羧化率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。其中A組UOC水平均低于其他各年齡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；E組OC水平均高于其他各年齡組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B、C、D組OC未羧化率均高于A組，且B組又高于E組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 相關(guān)分析結(jié)果 血清UOC、OC水平均與年齡呈正相關(guān)(r值分別為0.49和0.38，P均<0.01)；而OC未羧化率與年齡無線性相關(guān)關(guān)系(r=-0.48，P=0.71)。

表1 各年齡組小兒UOC、OC及OC未羧化率比較

注：UOC=未羧化骨鈣蛋白，OC=骨鈣蛋白；與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，★P<0.05；與D組比較，■P<0.05

3 討論

維生素K發(fā)現(xiàn)于20世紀30年代，既往人們認為其只參與凝血，但近十幾年來研究發(fā)現(xiàn)，維生素K不僅與血液凝固有關(guān)，還參與骨代謝。1975年，Pettifor等[2]發(fā)現(xiàn)孕婦口服抗凝劑所產(chǎn)嬰兒鼻骨發(fā)育不全，首次報道了維生素K缺乏對人體骨發(fā)育的影響，提出維生素K參與人體骨代謝的假說。從此，維生素K凝血以外的功能引起了人們的高度重視。

維生素K本身并不參與凝血因子的合成或具體的凝血過程，而是作為羧化酶的輔酶參與維生素K依賴性凝血因子Ⅱ、Ⅻ、Ⅸ、Ⅹ的合成，催化某些蛋白質(zhì)中的谷氨酸殘基轉(zhuǎn)化為γ-羧基谷氨酸殘基，這類蛋白質(zhì)又稱為維生素K依賴性蛋白質(zhì)。人體中維生素K依賴性蛋白質(zhì)主要有3種，其中與凝血無關(guān)的是OC，所有種屬OC的共同特點是在第17、21、24位上有3個維生素K依賴性γ-羧基谷氨酸殘基。骨組織具有把谷氨酸殘基羧化為γ-羧基谷氨酸殘基的維生素K依賴羧化系統(tǒng)。未發(fā)生羧化反應(yīng)的谷氨酸殘基不具有結(jié)合鈣離子的化學特性。因此機體內(nèi)的OC有兩種存在形式，即UOC和γ-羧化OC，通常提到的OC是指這兩種形式OC的總和[1]。理論上，在維生素K充足，羧化酶功能正常的情況下，UOC完全轉(zhuǎn)化為羧化OC。因此，根據(jù)UOC所占總OC的比例即OC未羧化率，可以計算出體內(nèi)OC的未羧化程度，而OC的未羧化程度與維生素K對成骨細胞的供應(yīng)量有關(guān)，這就是OC未羧化率用于反映機體成骨細胞是否缺乏維生素K的理論基礎(chǔ)。由于不同實驗室免疫動物所采用的OC抗原不盡相同，OC檢測方法的標準化困難，影響因素多，故文獻報道的OC數(shù)值變異很大[3]。有動物研究發(fā)現(xiàn)，相對較低的維生素K攝入量，凝血酶原的羧化就能達到最大程度，進一步增加維生素K攝入量，可使尿γ-羧基谷氨酸繼續(xù)增高[4]，表明凝血因子以外的維生素K依賴性蛋白質(zhì)尚未達到最大程度的羧化，OC羧化所需維生素K的含量更高[5]，維生素K缺乏的影響更易在骨代謝上表現(xiàn)出來[6]。

細胞培養(yǎng)證實OC的合成受維生素D與維生素K的共同調(diào)節(jié)，維生素D直接在基因轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮作用，維生素K參與蛋白質(zhì)的翻譯后羧化修飾過程[7]，而OC促進骨的礦化作用已經(jīng)肯定，因此可以通過測定血清OC的未羧化率來評價機體的骨骼維生素K營養(yǎng)狀況，有助于了解不同年齡段小兒骨代謝受維生素K影響的不同程度，以便更好地指導(dǎo)臨床預(yù)防性用藥。本研究將在我院就診的62例健康兒童按年齡的不同分為5組，分別測定各組兒童的血清UOC、OC水平，從而計算OC未羧化率。結(jié)果顯示，在兒童期UOC、OC水平隨年齡變化呈動態(tài)演變的過程，0～3個月UOC水平顯著低于其他年齡段小兒，>9～14歲OC水平顯著高于其他年齡段小兒；>3個月～1歲、>1～3歲、>3～9歲小兒OC未羧化率均顯著高于0～3個月小兒，且>3個月～1歲小兒OC未羧化率還顯著高于>9～14歲小兒。這是不同年齡段小兒骨骼維生素K營養(yǎng)狀態(tài)不同所致。這表明>3個月～1歲小兒成骨細胞的維生素K的相對缺乏程度較重，維生素K對骨骼的供應(yīng)也就最為缺乏，與臨床上該年齡段小兒最易發(fā)生骨代謝異常，易患佝僂病相吻合，在今后的臨床工作中該年齡段小兒維生素K的預(yù)防性應(yīng)用更應(yīng)受到重視。

骨骼維生素K水平作為評價骨代謝的一項重要生化指標已經(jīng)得到了確認，但在小兒階段骨代謝受年齡增長、性別、生長速率、營養(yǎng)狀況以及青春期階段等更多因素的影響，因此對這個階段的骨代謝進行評價及判斷難度更大；同時本研究提醒在小兒不同的年齡段應(yīng)確立不同的參考值，因此對骨骼維生素K更準確、簡便的檢測手段以及參考值的建立，還需要在以后的臨床工作和實驗中做進一步的探討及研究。

1 張會豐，李偉.機體維生素K營養(yǎng)狀況評價指標的研究進展[J].國外醫(yī)學·衛(wèi)生學分冊，2001，28(5)：292-294.

2 Pettifor JM，Benson R.Congenital malformations associated with the administration of oral anticoagulants during pregnancy[J].J Pediatr，1975，86(3)：459-462.

3 Gundberg CM，Nieman SD，Abrams S，et al.Vitamin K status and bone health an analysis of methods for determination of undercarboxylated osteocalcin[J].J Clin Endocrinol Metab，1998，83(9)：3258-3266.

4 Craciun AM，Groenen-van Dooren MM，Vermeer C.Nutritional vitamin K-intake and urinary gamma-carboxyglutamate excretion on the rat[J].Binchem Biophys Acta，1997，1334(1)：44-50.

5 Sato T，Ohtani Y，Yamada Y，et al.Difference in the metabolism of vitamin K between fiver and bone in vitamin K-deficient rates[J].Br J Nutr，2002，87(4)：307-314.

6 陶天遵，楊小清，陶樹清，等.維生素K與骨代謝[J].國外醫(yī)學·內(nèi)分泌學分冊，2005，25(5)：298-301.

7 Auf′mkolk B，Hausehka PV，Schwartz ER.Characterization of human bone cells in culture[J].Calcif Tissue Int，1985，37(3)：228-235.