曹冬梅，胡耀輝

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

β-環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（β-cyclodextrin glycosyltransferase，β-CGTase）是一種多功能型酶[1]，能通過(guò)環(huán)化、偶合、歧化、水解等反應(yīng)作用于淀粉使葡萄糖基發(fā)生轉(zhuǎn)移生成環(huán)糊精[2]。其中環(huán)化反應(yīng)生成的β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD）對(duì)許多物質(zhì)具有包絡(luò)作用，增加了被包絡(luò)客體分子的水溶性、穩(wěn)定性、乳化性、釋放性及其他物理性質(zhì)。這使得環(huán)糊精及其各種衍生物可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、造紙、紡織、石油、化工、環(huán)保、超分子化學(xué)、光敏材料、納米材料以及其他功能材料十幾個(gè)行業(yè)，有力的帶動(dòng)了這些行業(yè)的發(fā)展[3]。

工業(yè)化生產(chǎn)環(huán)糊精的技術(shù)是日本率先在20世紀(jì)70年代實(shí)現(xiàn)的，隨后美國(guó)、德國(guó)、荷蘭、匈牙利及中國(guó)相繼發(fā)展了該項(xiàng)技術(shù)。目前日本和歐美的環(huán)糊精產(chǎn)量相當(dāng)，據(jù)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，近幾年環(huán)糊精國(guó)際市場(chǎng)產(chǎn)量呈25%的趨勢(shì)增長(zhǎng)，至2011年其世界生產(chǎn)量已達(dá)40萬(wàn)t，并且隨著環(huán)糊精廣泛應(yīng)用，環(huán)糊精市場(chǎng)將會(huì)保持超高速增長(zhǎng)[4]。但目前β-環(huán)糊精的工業(yè)化生產(chǎn)中，淀粉轉(zhuǎn)化率低，為50%～60%，很難有進(jìn)一步突破[5]。為了提高β-CD的產(chǎn)量，首先需提高β-CGTase的產(chǎn)量。

本研究對(duì)前期實(shí)驗(yàn)室自長(zhǎng)白山溫泉選育出來(lái)的一株產(chǎn)β-CGTase的高溫菌株HY15產(chǎn)酶時(shí)的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)研究其基因改造、酶的純化和酶的性質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：長(zhǎng)白山溫泉采集分離保存的高溫菌株HY15。

種子培養(yǎng)基為L(zhǎng)B 培養(yǎng)基[6]：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0，120℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：可溶性淀粉10g，酵母膏5g，蛋白胨10g，Na2CO30.5g，K2HPO4·3H2O 0.13g，pH7.0，120℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。

1.2 儀器與設(shè)備

InfiniteM200酶標(biāo)儀：TECAN公司；UV-1700PharmaSpec紫外可見分光光度計(jì)：日本島津；TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)：上海菲恰爾分析儀器有限公司；DL-CJ-IND超凈工作臺(tái)：北京市東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DSH2-300恒溫培養(yǎng)振蕩箱：江蘇太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；CL-32L高壓蒸汽滅菌器：日本ALP公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵方法

取種子培養(yǎng)基1.5mL接種至裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，于60℃、200r/min振蕩培養(yǎng)48h。

1.3.2 生物量測(cè)定

取1mL發(fā)酵菌液用蒸餾水定容至10mL，測(cè)定吸光度值（OD600nm）。

1.3.3 酶活力測(cè)定[13]

取粗酶液（發(fā)酵菌液10000r/min離心3min，上清液即為粗酶液）10μL，用蒸餾水定容至100μL，取稀釋液10μL（對(duì)照不加樣品）加入0.2mol/L的甘氨酸-NaOH-NaCl緩沖液（pH8.55）0.2mL，置于40℃水浴鍋中，加0.2%馬鈴薯淀粉溶液200μL（空白樣不加）后計(jì)時(shí)10min馬上放入冰水浴中，加入濃度為0.5mo1/L的醋酸0.5mL終止反應(yīng)，再加入0.005%碘液3mL顯色，以蒸餾水為空白，不加酶液為對(duì)照，測(cè)定吸光度值（OD600nm），以吸光度值下降10%的酶量定為1個(gè)酶活單位。酶活力計(jì)算公式：

式中：a 為對(duì)照組的吸光度值，b 為樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 不同碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶活力的影響

在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加1%糊精、1%玉米淀粉、1%糖蜜、1%可溶性淀粉、1%麥芽糖、1%乳糖、1%果糖、1%馬鈴薯淀粉等碳源，按1.3.1方法發(fā)酵后，酶活力測(cè)定結(jié)果見圖1。

圖1 不同碳源對(duì)菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.1 Effects of different carbon sources onβ-CGTase production

由圖1可知，該菌株利用最好的碳源是玉米淀粉和糖蜜，其余依次是馬鈴薯淀粉、可溶性淀粉、糊精、果糖、麥芽糖、乳糖?？紤]到當(dāng)?shù)氐挠衩踪Y源豐富，生產(chǎn)成本低，因此初步定為玉米淀粉+糖蜜作為復(fù)合碳源。

2.1.2 不同氮源對(duì)菌株產(chǎn)β-CGTase的影響

以1%玉米淀粉+1%糖蜜為碳源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別以1%酵母浸粉、1%玉米漿、1%蛋白胨、1%尿素、1%（NH4）2SO4、1%NH4NO4、1%NH4Cl為氮源，發(fā)酵48h后，酶活力測(cè)定結(jié)果見圖2。

圖2 不同氮源對(duì)菌種產(chǎn)酶活力的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources onβ-CGTase production

由圖2可知，產(chǎn)酶量較高的是酵母浸粉和玉米漿，其次是蛋白胨和尿素，該菌株對(duì)3種無(wú)機(jī)氮源可以利用，但產(chǎn)酶量很低。因考慮當(dāng)?shù)刭Y源和生產(chǎn)成本原因，選擇玉米漿為氮源，玉米漿也是微生物生長(zhǎng)很普遍應(yīng)用的有機(jī)氮源，含有豐富的可溶性蛋白、生長(zhǎng)素和一些前體物質(zhì)。

2.1.3 培養(yǎng)基中起始MgSO4濃度對(duì)菌株產(chǎn)CGTase的影響

以1%玉米淀粉+1%糖蜜為碳源，1%玉米漿為氮源，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上分別添加不同濃度的MgSO4，發(fā)酵48h后，酶活力測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖3 不同濃度的MgSO4對(duì)酶活力的影響Fig.3 Effects of different concentration of MgSO4 onβ-CGTase production

由圖3可知，隨著MgSO4濃度增加，酶活力增加，在MgSO4濃度達(dá)到10mmol/L時(shí)菌體酶活力達(dá)到了最高。說(shuō)明MgSO4對(duì)菌株酶活力有促進(jìn)作用，當(dāng)繼續(xù)增大MgSO4濃度，菌株酶活呈下降趨勢(shì)。因此MgSO4的添加量初步確定為10mmol/L。這可能與Mg2+在微生物發(fā)酵代謝過(guò)程中是許多酶的激活劑有關(guān)系[6]。

2.2 發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

2.2.1 最適發(fā)酵溫度的確定

在不同溫度發(fā)酵48h后測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖4。發(fā)酵溫度為60℃時(shí)，酶活力達(dá)到最高。

圖4 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株HY15產(chǎn)酶活力的影響Fig.4 Effect of temperature onβ-CGTase production

2.2.2 最適pH值的確定

用NaOH或HCl調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH值分別為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，發(fā)酵48h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖5。在初始pH值為7.0時(shí)，菌體的產(chǎn)酶量最高。pH值過(guò)高或過(guò)低都不利于菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶。

圖5 初始pH值對(duì)菌株產(chǎn)β-CGTase的影響Fig.5 Effect of pH value onβ-CGTase production

2.2.3 最適搖床轉(zhuǎn)速的確定

以110r/min、140r/min、170r/min、200r/min、230r/min作為搖床轉(zhuǎn)速，發(fā)酵溫度60℃，pH7.0，接種量3%，發(fā)酵48h后測(cè)定酶活，結(jié)果見圖6。適宜的搖床轉(zhuǎn)速為200r/min。發(fā)酵液中溶氧對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物生成的影響很大，搖瓶的溶氧值與搖床轉(zhuǎn)速有關(guān)。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化β-CGTase 的發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、初始pH值、MgSO4濃度、轉(zhuǎn)速為試驗(yàn)因素，以發(fā)酵產(chǎn)物的酶活力為指標(biāo)，采用L27（36）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵條件，考慮到碳源和氮源、碳源和初始pH值、氮源和初始pH值可能存在交互作用，因此設(shè)計(jì)因素與水平見表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2，直觀分析結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

圖6 轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)β-CGTase的影響Fig.6 Effects of rotation speed of shaker on β-CGTase production

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels oforthogonal experiments for fermentation condition optimization

表2 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiments for fermentation condition optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果直觀分析Table 3 Intuitionistic analysis of orthogonal experiments results

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表3 所得極差可知，對(duì)產(chǎn)β-CGTase 酶活力影響依次為氮源＞碳源＞培養(yǎng)溫度＞初始pH值＞搖床轉(zhuǎn)數(shù)＞MgSO4＞空列。由表4可知，因素A、B即碳源、氮源對(duì)酶活影響極顯著，B×C、C、A×C、E、A×B對(duì)酶活影響顯著，碳源和氮源、碳源和初始pH值、氮源和初始pH值的確存在交互作用，而且作用顯著。由表3可看出，碳源水平1和水平2差異不顯著，與水平3差異顯著，氮源3個(gè)水平間差異均顯著。因此選擇發(fā)酵產(chǎn)β-CGTase的最佳試驗(yàn)組合是A3B2C1D2E3F2，即碳源為玉米淀粉+糖蜜，氮源為玉米漿，初始pH值為7.0，培養(yǎng)溫度60℃、搖床轉(zhuǎn)速220r/min，MgSO4濃度10mmol/L，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，β-CGTase 酶活力可高達(dá)1794.3U/mL。高于所有正交試驗(yàn)組合的結(jié)果，表明正交試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

3 結(jié)論

β-CGTase己從多種微生物中分離得到，包括浸麻芽孢桿菌（Bacllius macerna）、嗜熱脂肪芽孢桿菌（B.stoaorthermpohlisi）、耐堿性巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、微球菌（Micorcoccussp.）、枯草芽孢桿菌（B.subtils）等[17-19]。但報(bào)道較多的是嗜堿芽孢桿菌，產(chǎn)酶水平為2000U/mL～4000U/mL[19]。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株HY15的產(chǎn)酶培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定了碳源為玉米淀粉+糖蜜，氮源為玉米漿，初始pH值7.0，培養(yǎng)溫度60℃、搖床轉(zhuǎn)速220r/min，MgSO4濃度10mmol/L，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，β-CGTase 酶活力可達(dá)1794.3U/mL。略低于報(bào)道的產(chǎn)酶水平，可能與本研究所采用當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)產(chǎn)品糖蜜、玉米漿的添加量有關(guān)。但本試驗(yàn)所采用的菌產(chǎn)生的酶為嗜熱酶，在酶的工業(yè)化生產(chǎn)可采用快捷的加熱純化法、高溫酶解，防止雜菌生存，提高反應(yīng)速率。為后續(xù)該菌的基因改造提供理論基礎(chǔ)。

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