彭維兵，陳維云，王雪，陳錫強，劉可春

(山東省科學院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014)

現(xiàn)代科學研究表明，自由基在人體的衰老和腫瘤的發(fā)病過程中起著非常重要的作用，尤其是羥自由基和超氧陰離子與心血管疾病、癌癥、高血壓、炎癥的休克等都有密切的關系［1－4］。機體抗氧化酶的活性降低和過多自由基的生成，致使人體內(nèi)積蓄了大量的氧自由基，活性氧自由基的平衡被打破，從而過量地損傷細胞，進而危害人類的健康。因此，研究并開發(fā)高效低毒性的、能夠保護人類機體免受過量自由基損害的藥物或者保健品，成為人們關注的熱點［5－8］。

目前，抗氧化劑大多為合成的物質，純天然的物質并不多見。本課題組從純天然食品花生中提取、分離得到了分子量在1 kD以下的花生肽，并對花生肽的作用，如對小鼠的抗運動性疲勞作用、四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用及對原發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用進行過較為系統(tǒng)的實驗研究，證實了其在上述各方面的藥理活性［9－11］。本文將繼續(xù)探討花生肽的體外抗氧化活性，為其廣泛應用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 藥物與試劑

花生肽樣品:實驗室自制，分子量在1 kD以下;Tris-Hcl，硫代巴比妥酸(TBA)，1，1-二苯基-2-三硝苯肼(DPPH)，三氯乙酸(TCA)，butylated hydroxytoluene(BHT)均購于Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA);硫酸亞鐵，無水乙醇，過氧化氫等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

Anke TGL-16C/Anke TDL-5離心機，上海安亭科學儀器廠;BIO-TEK全自動酶標儀，美國。

2 實驗方法

2.1 DPPH自由基的清除能力的測定［12］

準確稱取DPPH樣品4 mg，用無水乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得到濃度為0.04 mg/mL的DPPH 母液，于0 ～4℃避光保存。將花生肽樣品配成濃度分別為 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mg/mL 的樣品溶液，并將濃度為0.04 mg/mL的DPPH溶液4 mL與上述溶液各1 mL分別加入試管混合，充分搖勻，在暗室中放置30min后，以無水乙醇作為空白對照，以BHT作為陽性對照，在517 nm下用酶標儀測定吸光度值A，并用下列公式計算清除率，清除率數(shù)值越大表示其抗氧化能力越強。

清除率=［(A0–A1)/A0］×100%，

其中:A0為4.0mL DPPH溶液和1 mL無水乙醇的吸光度值;A1為4.0mL DPPH溶液和待測溶液的吸光度值。

2.2 還原力的測定［13］

分別取 1.0mL 濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1 mg/mL 的花生肽被測溶液加入試管中，再加入 2.5 mL 濃度為0.01 mg/mL的鐵氰化鉀和2.5 mL pH值為6.6、濃度為0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，均勻混合，放置于50℃的電熱恒溫水浴鍋中反應20min，然后加入2.5 mL濃度為0.1 mg/mL的三氯乙酸，充分搖勻，并3500 r/min離心10min。吸取2.5 mL上清液，加入濃度為0.01 mg/mL的三氯化鐵溶液0.5 mL和蒸餾水2.5 mL。在700 nm波長下測定樣品吸光度值。

2.3 抗脂質過氧化能力的測定［14－15］

首先配制pH值為7.45濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用其按照1:25的比例配制成卵黃懸液。在試管中分別加入濃度為0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 和6.4 mg/mL 的被測溶液 1.0mL，再加入濃度為25 mmol/L的硫酸亞鐵0.4 mL和0.4 mL卵黃懸液，最后用pH值為7.45濃度為0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液補充至4 mL，在37℃氣浴恒溫振蕩器中振蕩15 min后，加入濃度為20mg/mL的三氯乙酸(TCA)1.0mL，靜置10min，并3500 r/min離心10min，吸取上清液4 mL，加入濃度為0.8mg/mL的TBA 2 mL，于沸水浴中15 min，冷卻，以6 mL PBS為空白管調零，以BHT作為陽性對照，在532 nm下用酶標儀測定吸光度值，用對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率表示樣品的抗氧化活性，用下列公式計算:

抑制率I%=(A0－A)/A0×100%，

其中，不加樣品管的吸光度為A0，樣品管的吸光度為A，

2.4 統(tǒng)計學方法

3 實驗結果

3.1 花生肽對DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，在0.1～3.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，維生素C對DPPH自由基的清除率基本保持不變，其清除率在92.4%左右?；ㄉ膶PPH自由基的清除率隨濃度增加逐漸上升，當濃度達到3.2 mg/mL時，花生肽對DPPH自由基的清除率為78.7%，但低于維生素C。

3.2 花生肽的還原能力

從圖2可知，在0.1～1 mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著花生肽濃度的增加，其還原能力增強。維生素C在0～0.2 mg/mL濃度范圍內(nèi)，還原能力逐漸增強，在濃度為0.2 mg/mL時，還原能力達到2.8?；ㄉ臉悠窛舛仍? mg/mL時，還原能力達到1.7。表明花生肽樣品具有一定的還原能力，但還原能力不如維生素C強。

圖1 花生肽在不同濃度下清除DPPH自由基能力分析Fig.1 Analysis of DPPH free radical scavenging capability of peanut peptides under different concentrations

圖2 花生肽在不同濃度下的還原能力分析Fig.2 Reducing capability analysis of peanut peptides under different concentrations

3.3 花生肽抗脂質過氧化能力的測定

圖3表明，在0.2～6.4 mg/mL濃度范圍內(nèi)，維生素C對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率基本保持不變，其抑制率在95%左右。花生肽對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率隨濃度增加逐漸上升，當濃度達到6.4 mg/mL時，花生蛋白肽對卵黃脂蛋白脂質過氧化的抑制率為78.6%。

圖3 花生肽在不同濃度下抗脂質過氧化能力分析Fig.3 Analysis ofanti-lipid peroxidation capability of peanut peptides under different concentrations

4 結論

花生肽作為純天然的保健食品，在人們的生活中已經(jīng)得到廣泛應用，但是對分子量在1 kD以下的花生肽的相關研究較少。本文對花生肽的體外抗氧化作用進行了初步探討，證實了花生肽對DPPH自由基具有較好的清除能力和一定的還原能力，并對卵黃脂蛋白脂質過氧化具有較好的抑制作用，具有進一步開發(fā)成為保健食品的可行性。

在以前的研究中，作者也驗證了花生肽的抗疲勞、治療肝損傷和降血壓的作用。這些較為系統(tǒng)的研究，為花生肽開發(fā)成為具有多種功效的保健食品提供了理論依據(jù)。

［1］CUZZOCREA S，RILEY D P，CAPUTI A P，et al.Anti-oxidant therapy:A new pharmacological approach in shock，in-flammation，and ischemia/reperfusion injury［J］.Pharmacol Rev，2001，53(1):135 – 159.

［2］鐘秀倩.氧自由基與疾?。跩］.韶關學院學報，2006;27(6):87－90.

［3］王麗萍，王軼.自由基對骨關節(jié)炎的影響［J］.中華風濕病學雜志，2006;10(2):116－118.

［4］姚堯，杜俊蓉，錢忠明.番茄紅素抗氧化及腫瘤預防作用的研究進展［J］.國外醫(yī)學:藥學分冊，2005，32(5):308－311.

［5］GRICE H C.safety evaluation of butylated hydroxyanisole from the prospective of effect on forestomach and oesophageal squamous epithelium［J］.Food and Chem Toxicologly，1988，26(8):717 －723.

［6］CHEN R H ，CHANG J R ，SHYUR J S.Effects of ultrasonic conditions and storage in acidic solutions on changes in molecular weight and polydisperity of treated chitosan［J］.Carbohydrate Research，1997，299(4):287 －294.

［7］HONDA S，SUZUKI S.Separation of oligosaccharides by capillary electrophoresis using buffer modifiers［J］.Capillary Electrophoresis of Carbohydrates.2003，213:93 －104.

［8］BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，78(112):248 －254.

［9］彭維兵，何秋霞，劉可春，等.花生肽對四氯化碳致小鼠肝損傷的保護作用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，17(9):71－73.

［10］彭維兵，何秋霞，劉可春，等.花生肽對小鼠抗運動性疲勞的實驗研究［J］.山東科學，2011，24(5):35－38.

［11］彭維兵，何秋霞，劉可春，等.花生肽對原發(fā)性高血壓大鼠的降壓作用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2012，18(8):73－75.

［12］BRACA A，de TOMMASI N ，di BARI L D，et al［J］.Antioxidant principles from Bauhinia terapotensis［J］.Journal of Natural Products，2001，64(7):892 －895.

［13］DORMAN H J D，HILTUNEN R.Fe(III)reductive and free radical-scavenging properties of summer savory(Satureja hortensis L.)extract and subfractions［J］.Food Chem，2004，88(2):193 －199.

［14］PRIETO P，PINEDA M，AGUILAR M.Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphomolybdenum complex:Specific application to the determination of vitamin E［J］.Analytical Biochemistry，1999，269(2):337－341.

［15］張爾賢，俞麗君.鼠尾藻多糖清除氧自由基作用的研究Ⅱ UVc鼠尾藻對多糖抗氧化作用的影響［J］.中國海洋藥物，1997(3):1－4.