陳 農(nóng)，李賀敏，彭國平，鄭云楓，李存玉，蔣 穎

(南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210029)

斑蝥素(cantharidin)是斑蝥抗癌的有效成份[1]，其結(jié)構(gòu)如圖1所示,斑蝥素除具有抗癌活性外，尚有抗病毒、壯陽、升高白細胞等多種活性[2],但由于其劇烈刺激性毒性以及對泌尿系統(tǒng)嚴重刺激性[3],限制了其在臨床的應(yīng)用。對斑蝥素進行系列的結(jié)構(gòu)修飾或改造，開發(fā)低毒且有效的斑蝥素衍生物，是尋找新型抗癌藥物的有效途徑。目前最常見的斑蝥素修飾產(chǎn)物是去甲斑蝥素(norcantharidin,簡稱NCTD)[4]，NCTD的合成路徑如圖2所示[5]。

在上述合成路線中，不飽和去甲斑蝥素是重要的中間產(chǎn)物，但對其研究并不成熟。目前對其修飾主要集中在2個方面，一方面是與NCTD類似的對酸酐環(huán)進行開環(huán)，酰胺化等反應(yīng)[6]；另一方面是對5,6位雙鍵的修飾，除了上述的催化加氫外，還包括溴水加成[7]和5或6位連接一些其他基團[8]，而含有這些基團的衍生物并沒有太高的抗癌活性。人工合成的NCTD抗腫瘤效果與斑蝥素相當(dāng),且毒性比斑蝥素要小的多[9]，而作為結(jié)構(gòu)介于二者之間的不飽和去甲斑蝥素，對其深入研究仍具有相當(dāng)?shù)囊饬x。本研究在合成NCTD路線的基礎(chǔ)上對雙鍵直接修飾得到新型斑蝥素衍生物；并以NCTD為對照，進行家兔眼刺激性驗，首次考察了此類衍生物的刺激性毒性，運用MTT法,考察各衍生物對人肝癌細胞株HepG-2,肺癌細胞A549和乳腺癌細胞MCF-7的體外抗癌活性。為探討斑蝥素衍生物結(jié)構(gòu)—抗癌活性—毒性之間的構(gòu)效關(guān)系提供參考，為尋找新型的低毒有效的斑蝥素衍生物提供了實驗基礎(chǔ)。

圖1 斑蝥素結(jié)構(gòu)

圖2 NCTD合成路線圖

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1.1.1 試劑與試藥 呋喃、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲酸、30%雙氧水、乙酸、1，4-二氧六環(huán)、二甲亞砜、磺酰氯等均為分析純，NCTD(購自中國藥品生物制品檢定所 110783-200604)。

1.1.2 儀器 85-1磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠)；RY-1型熔點儀(上海隆拓儀器設(shè)備有限公司,溫度未經(jīng)校正);AC-500型核磁共振儀(德國布魯克公司)；IR100型紅外光譜儀(KBr壓片及涂膜，美國尼高力儀器公司)；HH-S數(shù)顯恒溫油浴鍋(上海江星儀器有限公司)。

1.1.3 動物 成年新西蘭白兔，體質(zhì)量2～3 kg，形體健康，無病理體征，經(jīng)檢查兩眼均屬正常，結(jié)膜無充血，角膜透明無上皮脫落及損傷，符合動物實驗要求，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理毒理實驗室提供。

1.2 斑蝥素衍生物的合成 合成路線見圖3。

圖3 斑蝥素衍生物合成路線圖

1.2.1 化合物a不飽和去甲斑蝥素(7-氧雜雙環(huán)[2.2.1]庚-5-烯-2,3-二甲酸酐)的合成 呋喃和順丁烯二酸酐可以在常溫下發(fā)生經(jīng)典的D-A反應(yīng)，具體方法參照文獻[10]，得率92.1%，m.p.152～153℃。

1.2.2 化合物b(3,8-二氧雜三環(huán)[3.2.1.02 4]辛烷-6,7-二甲酸的合成)的合成 在100 mL單口燒瓶中依次加入3.32 g(20 mmoL)a，5 mL 30%雙氧水(約25 mmoL)，5 mL甲酸，常溫下敞口攪拌2 h，待固體完全溶解后，封口繼續(xù)攪拌2 h，將反應(yīng)液抽濾，濾餅用乙酸(10 mL×3)洗滌，干燥得白色固體b 3.46 g，得率86.5%，m.p.130～132 ℃。IR(KBr)νmax3079, 1732,1226 cm-1;1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ:2.91(s 1H),2.91(s 1H),3.45(s 1H),3.45(s H),4.58(s H),4.58(s 1H),12.29(s 1H-COOH)12.29(s,1H-COOH)。

1.2.3 化合物c(3,8-二氧雜三環(huán)[3.2.1.02 4]辛烷-6,7-二甲酸酐)的合成 在100 mL單口燒瓶中依次加入2.0 g b(10 mmoL)，40 mL SOCl2，50 ℃油浴鍋中回流10 h，反應(yīng)液冷卻至室溫后抽濾，濾餅用1,4-二氧六環(huán)(10 mL×3)洗滌，得淡黃色固體c 1.15g，得率63.2%，m.p.116～118 ℃。IR(KBr)νmax1824,1757,1126,1091 cm-1;1H NMR (CDCl3,300 MHz)δ:2.91(s 1H),2.91(s 1H),3.45(s 1H),3.45(s1H),4.58(s 1H),4.58(s 1H)。

1.3 化合物體外抗腫瘤活性實驗

1.3.1 實驗方法 采用美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的標準化抗腫瘤實驗方法(MTT)，對人肝癌細胞株HepG-2,肺癌細胞A549和乳腺癌細胞MCF-7進行試驗,以NCTD作為對照，檢測3個衍生物的體外抗腫瘤活性，以化合物抑制所選瘤株50%生長的濃度(IC50)作為判斷終點。

1.3.2 實驗結(jié)果 體外抗腫瘤實驗結(jié)果表明，化合物a,b和c對肝癌細胞HepG-2，肺癌細胞A549和乳腺癌細胞MCF-7均有一定的抑制作用,尤其是化合物b和c對肝癌細胞HepG-2有比NCTD更強的抑制作用，值得進一步研究(見表1)。

表1 各化合物的抗肝癌細胞HepG-2，肺癌細胞A549和乳腺癌細胞MCF-7的活性

1.4 化合物家兔眼刺激性試驗

1.4.1 供試品溶液配制 在預(yù)試的基礎(chǔ)上，分別將化合物a、b、c和NCTD用DMSO溶解配制,得10、25、50、100、200 μmol/L 5個濃度的系列供試品溶液。

1.4.2 實驗方法[11-13]采用同體自身對照，每組選用家兔4只，分別將不同濃度的4個化合物的DMSO溶液0.1 mL滴入家兔右眼結(jié)膜囊內(nèi),左眼滴入等體積的DMSO作陰性對照。給藥后兔眼被動閉合10 s左右，觀察并記錄滴眼后30、60、90 min的局部反應(yīng)情況。按表1要求將每只家兔與相應(yīng)溶液接觸后眼角膜、虹膜、結(jié)膜和分泌物的刺激反應(yīng)分值相加得到總積分，除以家兔數(shù)，得到該組眼刺激性的最終評分，按此方法分別求得各觀察時段的眼刺激分值，并以最高分值為準，并通過此分值來判斷此濃度下該化合物的刺激性程度。眼刺激性評價標準:無刺激性0～3分；輕刺激性4～8分；中刺激性9～12分；強刺激性13～16分(見表2)。

表2 眼刺激反應(yīng)評分

1.4.3 實驗結(jié)果 由表2可見，化合物b在眼刺激性反應(yīng)評分值最低，其次為化合物c，化合物NCTD比b、c要高，評分值最高的為化合物a。按照眼刺激性評價標準:化合物a在50 μmol/L時即為輕刺激性，隨著濃度的增大，刺激性增強，當(dāng)濃度為200 μmol/L時,化合物a為強刺激性；NCTD在濃度達到200 μmol/L時為輕刺激性;b和c在濃度200 μmol/L以內(nèi)均為無刺激性。由此可判這4個化合物的刺激性順序：a>NCTD>c>b(見表3)。

表3 不同濃度下各化合物給藥后刺激性結(jié)果

2 討論

本實驗在合成過程中采用的均為常見易得的氧化劑和酰化劑，反應(yīng)溫和，易于操作，且反應(yīng)進程單一，其他不良反應(yīng)的可能性較小，產(chǎn)率高，雜質(zhì)少，不需要經(jīng)過復(fù)雜的分離提純過程，具備了大生產(chǎn)化的可能；同時合成的2個化合物b和c都保留了化學(xué)活性較高的基團:羧基和酸酐，可以作為先導(dǎo)物與醇類，胺類等化合物反應(yīng)從而進一步衍生得到新的斑蝥素類化合物，具體工作已經(jīng)展開，研究成果將另行報道。

在合成基礎(chǔ)上，本研究利用家兔眼部刺激法和MTT法分別考察了3個化合物的刺激性毒性和抗癌活性，從中發(fā)現(xiàn)當(dāng)雙鍵被取代后，刺激性毒性大大降低，可以初步判斷雙鍵是導(dǎo)致不飽和去甲斑蝥素劇烈刺激性毒性的關(guān)鍵基團，雙鍵的消除有利于毒性的降低，而雙鍵被環(huán)氧環(huán)取代后，氧原子可以與受體形成氫鍵，更利于分子與受體間的適應(yīng)程度，使化合物具有較低的毒副作用的同時,又增強了化合物的抗腫瘤活性。羧酸型衍生物的刺激性b要比酸酐型衍生物c要小，則可以判斷羧酸基作為親水性基團，與酸酐環(huán)相比，生物利用度更高,更易于與機體細胞結(jié)合。

隨著對斑蝥素衍生化技術(shù)的日益成熟，在保證其臨床療效降低刺激性的同時，闡明衍生物結(jié)構(gòu)與藥理效應(yīng)是不可或缺的，本文明確了去甲斑蝥素中雙鍵飾衍生物的抗癌效應(yīng)和刺激性，對斑蝥素中關(guān)于雙鍵的衍生修飾提供了藥理學(xué)基礎(chǔ)。

[1]胡嶸,張輝,徐鳳英,等.抗病毒動物藥研究進展[J].吉林中醫(yī)藥,2003,23(12):56-57.

[2]曾文南,盧爵.斑鰲素及其衍生物的合成與活性研究進展[J].有機化學(xué),2006,26(5):579-591.

[3]鄒建軍,張勝強,馮瑞祥.斑蝥素毒性及其藥(毒)動力學(xué)研究[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報,2002,33(5):393-396.

[4]Stewart S G,Hill T A,Gilbert J,et al.Synthesis and biological evaluation of norcantharidin analogues: towards PP1 selectivity[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry,2007,15(23):7301-7310.

[5]董環(huán)文,劉超美,何秋琴,等.斑蝥素及其衍生物的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系研究進展[J].藥學(xué)實踐雜志,2007,25(5):276-280.

[6]Matthew E S,Adam M.Modified norcantharidins:synthesis,protein phosphatases 1 and 2Ainhibition,and anti Cancer activity[J].Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters,2004,14(10):1969-1973.

[7]蹇源,羅順忠,劉中林,等.斑蝥素衍生物的合成,標記及生物分布研究[J].核化學(xué)與放射化學(xué),2003,25(4):228-234.

[8]Essers M,Wibbeling B.HaufeG.synthesis of the first fluorinatedantharidin analogues[J].Tetra Lett,2001,42:5429-5430.

[9]薛金晶.去甲斑蝥素的作用機制與臨床應(yīng)用前景[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2007,23(1):138-139.

[10]田少雷，趙樹緯，朱愛堂.抗腫瘤藥物研究I:去甲斑鰲素氨基酸衍生物的合成與抗癌活性[J].藥學(xué)學(xué)報,1983,11(28):870-875.

[11]王北嬰,李儀奎.中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2001:815-817.

[12]梁光江,王延?xùn)|,葉成添,等.滴眼劑中幾種常用抑菌劑的兔眼刺激性實驗[J].中國藥房,2010,21(21):1964-1966.

[13]李岱,徐彥貴,林少春,等.漢防己甲素滴眼液對家兔眼刺激性實驗研究[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2010,24(5):374-376.