肥大細(xì)胞來源于骨髓造血細(xì)胞，進(jìn)入外周循環(huán)系統(tǒng)，在血管組織或漿膜腔中完成分化和(或)成熟，通過局部分泌炎癥介質(zhì)或引發(fā)系統(tǒng)反應(yīng)參與炎癥反應(yīng)的多個(gè)步驟[1]。既往數(shù)十年內(nèi)，肥大細(xì)胞被認(rèn)為在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而近年來研究發(fā)現(xiàn)，在多種免疫應(yīng)答中，尤其是在持續(xù)性炎癥及組織重建的狀態(tài)下(如肝硬化，肺纖維化及傷口愈合等)過程中[2]，肥大細(xì)胞的分布常伴隨纖維化形成，表明肥大細(xì)胞可能參與這些病理過程[3]。近年來研究也發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病、IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、急性間質(zhì)性腎炎和慢性間質(zhì)性腎炎等多種腎臟疾病中，均存在肥大細(xì)胞增多現(xiàn)象[8-14]。我們前期研究以腎移植供腎為對照也發(fā)現(xiàn)，抗腎小球基膜(GBM)腎炎患者腎組織中肥大細(xì)胞數(shù)量明顯增多。鄭敬民等[9]曾報(bào)道肥大細(xì)胞加重腎臟炎癥及纖維化，并通過脫顆粒分泌類胰蛋白酶至腎臟間質(zhì)進(jìn)而參與糖尿病腎病過程。

單核巨噬細(xì)胞被認(rèn)為在新月體及腎間質(zhì)損害中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6-8]，單核細(xì)胞在腎小球及腎間質(zhì)的浸潤被認(rèn)為是急進(jìn)性新月體形成及腎間質(zhì)改變的起始事件，而肥大細(xì)胞由于與單核巨噬細(xì)胞擁有類似表型特征[9]，故其可能也參與新月體腎炎的發(fā)生發(fā)展過程[10]?？笹BM腎炎，以急進(jìn)性腎炎(RPGN)為特征，起病急驟，進(jìn)展迅速，預(yù)后差；病理表現(xiàn)為腎小球大量新月體形成及包囊壁斷裂，間質(zhì)炎癥反應(yīng)和纖維化病變程度與腎小球病變的嚴(yán)重程度相平行，并直接影響患者的預(yù)后。已有部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道肥大細(xì)胞在抗GBM腎炎中的作用，但在人類抗GBM腎炎中卻鮮有報(bào)道。本文對抗GBM腎炎患者腎組織中肥大細(xì)胞的數(shù)量、分布、臨床及組織病理的關(guān)系進(jìn)行了分析研究。

對象與方法

病例選擇選取2001年～2010年經(jīng)腎活檢明確診斷為抗GBM腎炎的患者38例，所有患者均予以甲潑尼龍沖擊治療后續(xù)口服潑尼松/嗎替麥考酚酯或環(huán)磷酰胺沖擊治療。收集患者臨床及病理資料，根據(jù)患者腎活檢病理組織中肥大細(xì)胞數(shù)量將38例患者分為組1(肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)<50 個(gè)/mm2，n=18)及組2(肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)≥50 個(gè)/mm2，n=20)，比較兩組患者臨床資料、實(shí)驗(yàn)室檢查及病理結(jié)果。

臨床資料及實(shí)驗(yàn)室檢查臨床資料數(shù)據(jù)，包括一般狀況、性別、年齡、病程及臨床表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)室檢查，包括尿蛋白定量，尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)，腎小管功能指標(biāo)[N-乙酸-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG酶)，視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)]，血紅蛋白，血清肌酐(SCr)和血清學(xué)試驗(yàn)(如抗GBM抗體滴度、補(bǔ)體C3和C4)。

高血壓定義為成人靜息收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓≥90 mmHg；兒童收縮壓≥120 mmHg和(或)舒張期血壓≥80 mmHg，至少需兩次測量。鏡下血尿定義為尿沉渣紅細(xì)胞計(jì)數(shù)≥1.0萬/ml。蛋白尿定義為尿蛋白定量>0.4 g/24 h。腎病綜合征定義為尿蛋白定量≥3.5 g/24 h，血清白蛋白<30 g/L。腎功能不全定義為SCr>109.62 μmol/L。慢性腎功能衰竭(CRF)定義為SCr>109.62 μmol/L持續(xù)至少3月，腎皮質(zhì)回聲增強(qiáng)。根據(jù)2012年KDOQI將急性腎損傷(AKI)定義為48h內(nèi)SCr升高≥26.52 μmol/L，或者7d內(nèi)SCr升高至≥1.5倍基礎(chǔ)值，或者尿量<0.5 mL/(kg·h)達(dá)6h。終末期腎病(ESRD)定義為SCr≥530 μmol/L 或腎臟替代治療超過3月。

組織學(xué)檢查光鏡，腎穿刺活檢標(biāo)本經(jīng)氯化汞-苦味酸，石蠟包埋，切片1.5 μm。分別HE、PAS、PASM-Masson和Masson三色染色。觀察腎小球，腎小管間質(zhì)及血管病變。腎小管和間質(zhì)慢性病變的程度根據(jù)受累的范圍進(jìn)行半定量評分：1分(輕度，<25%)，2分(中度，25%～50%)，3分(重度，>50%)。常規(guī)石蠟切片免疫組化Envision法檢測間質(zhì)和腎小球T淋巴細(xì)胞(CD4、CD8)，巨噬細(xì)胞(CD68)陽性和增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)陽性細(xì)胞。以NIS E1 ement BR3.4軟件測量所選區(qū)域間質(zhì)面積，得到浸潤炎癥細(xì)胞平均數(shù)。免疫熒光采用直接法IgG、IgA、IgM、C3、及C1q染色。

腎臟肥大細(xì)胞的檢測胰蛋白酶(Novocastra公司，1∶2 000)免疫組化染色進(jìn)行標(biāo)記腎肥大細(xì)胞。CD68(DaKo公司，1∶100)用于標(biāo)記巨噬細(xì)胞。使用單盲方法一個(gè)高倍視野下兩個(gè)不同的研究者觀察，對至少20個(gè)隨機(jī)選擇的區(qū)域進(jìn)行了檢查，對胰蛋白酶免疫組化染色陽性的細(xì)胞(肥大細(xì)胞)的總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)。以NIS E1 ement BR3.4軟件測量所選區(qū)域間質(zhì)面積，得到肥大細(xì)胞平均數(shù)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料根據(jù)其是否正態(tài)分布分別以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)(25%分位數(shù)～75%分位數(shù))表示，分類數(shù)據(jù)采用率(百分比)表示。組間均值比較采用t檢驗(yàn)或Mann-Whitney U檢驗(yàn)，兩組之間率的比較采用χ2檢驗(yàn)及確切概率法檢驗(yàn)，變量間相關(guān)性探討采用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

結(jié) 果

一般情況和臨床特點(diǎn)所有患者均表現(xiàn)為RPGN，65.8%患者伴肉眼血尿，84.2%合并高血壓。組2患者病程較長，年齡較大，發(fā)生肉眼血尿患者較多，少尿/無尿比例較高且CRF較多但兩組之間無顯著差異(表1)。

表1 一般情況和臨床特征

實(shí)驗(yàn)室檢查組2患者SCr較高，而尿滲透壓較低，血尿及低蛋白血癥程度較輕盡管兩組間無顯著性差異，但觀察到組2患者蛋白尿較輕，貧血程度較重、抗GBM抗體滴度較高(表2)。

表2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果

組織學(xué)檢查組2患者腎小球硬化和包囊破裂比例較高且間質(zhì)纖維化程度重(P>0.05)，纖維性/纖維細(xì)胞新月體比例較高(P<0.05)，細(xì)胞性新月體比例較低(P>0.05)。組2腎組織間質(zhì)可見較多炎性細(xì)胞。尤其是CD8+細(xì)胞(180 個(gè)/mm2vs268 個(gè)/mm2，P<0.05)及CD68+細(xì)胞(534 個(gè)/mm2vs792 個(gè)/mm2，P<0.05)(表3)。免疫熒光均表現(xiàn)IgG沿腎小球毛細(xì)血管袢呈線狀沉積，常伴顆粒狀或非連續(xù)性C3沉積。當(dāng)新月體擠壓毛細(xì)血管袢只是血管袢開放欠佳時(shí)，IgG線狀沉積可不典型。

表3 兩組患者的組織病理學(xué)特征

表4 肥大細(xì)胞與臨床病理特征之間的相關(guān)性

討 論

肥大細(xì)胞作為炎癥細(xì)胞的重要成員，既往研究發(fā)現(xiàn)其在炎癥和纖維化部位有大量浸潤[1-3]。近年來對肥大細(xì)胞在新月體腎小球腎炎發(fā)病機(jī)制中作用的了解逐漸增多[11-13]。然而，在為數(shù)不多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)報(bào)道中關(guān)于肥大細(xì)胞在抗GBM腎炎中的作用所得結(jié)果并不一致，目前尚無關(guān)于肥大細(xì)胞在人類抗GBM腎炎的相關(guān)報(bào)道，其在抗GBM腎炎中的作用仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)在人類抗GBM腎炎腎組織間質(zhì)中肥大細(xì)胞浸潤并研究其與臨床及病理特征的關(guān)系。組2患者臨床表現(xiàn)及腎臟病理表現(xiàn)較組1慢性化表現(xiàn)較明顯。相關(guān)性分析表明，腎臟肥大細(xì)胞與新月體和腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞和CD8陽性T淋巴細(xì)胞的數(shù)量顯著相關(guān)。以上結(jié)果表明肥大細(xì)胞可能加重腎臟慢性病變。據(jù)報(bào)道，SCr高，少尿或無尿，晚期診斷等已被證實(shí)為腎臟預(yù)后較差的預(yù)測因素，起病時(shí)SCr水平是導(dǎo)致ESRD的獨(dú)立預(yù)測因素[14-17]。通過觀察一般情況和臨床特征，盡管兩組間無顯著差異，較多肥大細(xì)胞浸潤組(組2)患者具有病程較長，年齡較大，較少AKI和較多CRF的傾向，表明肥大細(xì)胞可能與慢性腎損害相關(guān)。臨床數(shù)據(jù)較高水平的SCr及尿RBP，但滲透壓較低，少尿/無尿比例較高，貧血程度較重，尿蛋白和鏡下血尿較少等慢性腎功能損害表現(xiàn)，及較高滴度的抗GBM抗體，也支持肥大細(xì)胞浸潤可能與慢性腎功能病變相關(guān)。在這些患者中，我們觀察到更多的肥大細(xì)胞浸潤，間接證明肥大細(xì)胞浸潤與腎臟慢性病變相關(guān)。

本研究中所有患者腎臟病理表現(xiàn)較重，均有>40%的新月體，平均為88.4%±17.7%，超過三分之一的患者新月體比例>85%，纖維性/纖維細(xì)胞性新月體達(dá)57.3%，與本研究中患者晚期診斷相關(guān)。隨著抗GBM腎炎疾病進(jìn)展，病理表現(xiàn)腎小球新月體可呈纖維細(xì)胞性隨后轉(zhuǎn)化為纖維性新月體，伴隨間質(zhì)纖維化等腎小管間質(zhì)損害的慢性化病變。兩組比較發(fā)現(xiàn)，組2纖維性/纖維細(xì)胞性新月體和球性硬化等晚期新月體比例較高，相關(guān)分析進(jìn)一步證實(shí)，肥大細(xì)胞浸潤與晚期新月體的比例呈正相關(guān)，表明肥大細(xì)胞參與腎小球慢性化病變，大量晚期新月體難以由免疫抑制治療逆轉(zhuǎn)和并導(dǎo)致ESRD。既往Tóth等[10]的研究也同樣發(fā)現(xiàn)在合并細(xì)胞纖維性新月體的腎小球腎炎中，肥大細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯增多。Timoshanko等[11]的研究也表明肥大細(xì)胞加重新月體腎炎進(jìn)展。人們研究已認(rèn)識(shí)新月體腎炎主要與Th1細(xì)胞和腎小球T細(xì)胞效應(yīng)相關(guān)[18]。Hochegger等[12]的研究中發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞可介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤。結(jié)合本研究及既往研究發(fā)現(xiàn)，肥大細(xì)可通過介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤進(jìn)而促進(jìn)新月體形成，但仍需進(jìn)一步研究證實(shí)肥大細(xì)胞在腎小球損傷的免疫調(diào)節(jié)的作用。

導(dǎo)致CRT進(jìn)展的病理改變除腎小球硬化外，也包括腎小管間質(zhì)纖維化[19]。本研究也顯示肥大細(xì)胞與腎小管間質(zhì)損傷相關(guān)。在病理切片中發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞浸潤主要分布于腎間質(zhì)(圖1)，較多肥大細(xì)胞浸潤的患者其間質(zhì)小管病變較嚴(yán)重，與臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果(較高的SCr和RBP)一致，表明肥大細(xì)胞可能與腎小管損傷相關(guān)，且可能是加重腎損害的另一因素。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，接受血液透析患者肥大細(xì)胞浸潤的程度往往更嚴(yán)重。肥大細(xì)胞與RBP、SCr和纖維化程度的水平正相關(guān)，也進(jìn)一步證實(shí)肥大細(xì)胞參與腎小管間質(zhì)損傷?；谶@些觀察，肥大細(xì)胞可通過促進(jìn)腎小管間質(zhì)損傷導(dǎo)致腎功能減退。在其他腎臟疾病中也同樣報(bào)道了相似的間質(zhì)病變[4，20]。據(jù)報(bào)道，腎小管間質(zhì)損害程度是腎功能進(jìn)行性下降重要決定因素之一[21]。這些研究發(fā)現(xiàn)均表明，肥大細(xì)胞在腎小管間質(zhì)損害中的作用不容忽視。實(shí)驗(yàn)性研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞促進(jìn)腎小管間質(zhì)損害的某些可能機(jī)制。部分研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)間質(zhì)纖維化、肥大細(xì)胞聚集與局部腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)作用密切相關(guān)[22-25],表明肥大細(xì)胞可能誘導(dǎo)RAS激活。并且肥大細(xì)胞能夠釋放各種成纖維因子和生長因子(包括組胺、類胰蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長因子及堿性成纖維細(xì)胞生長因子等)，而這些因子具有成纖維細(xì)胞促有絲分裂活性及可增強(qiáng)膠原蛋白的合成[2，26]。

圖1 肥大細(xì)胞主要分布于抗腎小球基膜腎炎患者腎組織腎間質(zhì)區(qū)域(↑)(IH，×200)

如前所述，肥大細(xì)胞可介導(dǎo)和增強(qiáng)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤。本研究中發(fā)現(xiàn)組2炎性細(xì)胞浸潤較組1增多，尤其是CD8細(xì)胞及CD68細(xì)胞。巨噬細(xì)胞已被證明在新月體形成中發(fā)揮重要的作用。巨噬細(xì)胞聚集可預(yù)測腎功能損害程度和疾病的進(jìn)展[27]?；诒疚南嚓P(guān)性分析中肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的正相關(guān)推測，肥大細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的相互作用可能在加重病情發(fā)展中起部分作用。T淋巴細(xì)胞可誘發(fā)間質(zhì)炎癥，加重腎損傷，且T細(xì)胞在新月體的形成及發(fā)展中同樣扮演不可忽視的角色。前文已述，肥大細(xì)胞具有介導(dǎo)T細(xì)胞聚集的作用。肥大細(xì)胞與T細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的相互作用可解釋肥大細(xì)胞加重腎臟損害的作用。這些假說也得到了其他研究的支持，揭示肥大細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的相互作用可促進(jìn)疾病惡化。肥大細(xì)胞可產(chǎn)生和釋放一些介質(zhì)，這些介質(zhì)可以調(diào)節(jié)生物反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)或炎性細(xì)胞浸潤[28]。Tanda等[29]的研究也發(fā)現(xiàn)浸潤的肥大細(xì)胞具有通過招募遲發(fā)型超敏反應(yīng)(DTH)白細(xì)胞浸潤誘導(dǎo)腎功能損傷的作用。這些局部效應(yīng)與肥大細(xì)胞在皮膚的DTH作用相似。肥大細(xì)胞和炎癥細(xì)胞之間的相關(guān)性表明，肥大細(xì)胞可促進(jìn)抗GBM腎炎腎臟炎癥反應(yīng)。

相關(guān)分析表明肥大細(xì)胞浸潤與球性硬化、腎間質(zhì)纖維化程度及間質(zhì)細(xì)胞浸潤(尤其是CD8及CD68陽性細(xì)胞)呈正相關(guān)。肥大細(xì)胞導(dǎo)致的腎功能減退可能與腎小球和腎小管的病理變化均有關(guān)，意味著肥大細(xì)胞可能與疾病晚期階段相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)我們的觀點(diǎn)——肥大細(xì)胞與腎臟慢性病變相關(guān)。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞促進(jìn)抗GBM腎炎的進(jìn)展，但由于臨床研究的限制，尚未明確其機(jī)制。而肥大細(xì)胞缺陷的大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)性研究表明肥大細(xì)胞在抗GBM腎炎扮演活躍角色，但各項(xiàng)研究并未得出一致結(jié)果，肥大細(xì)胞在腎臟損傷的作用目前仍有爭論，因此仍需要進(jìn)一步研究以明確其確切機(jī)制。

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