陳艷

摘 要：文章通過初步觀察大腸癌患者癌組織與正常成人腸黏膜蛋白質的差異表達，為進一步探討大腸的分子機制奠定基礎。應用蛋白質組學的雙向電泳技術，對大腸癌患者與正常成人腸黏膜蛋白質表達進行比較，觀察其差異點。得到分辨率和重復性均好的大腸癌患者與正常成人直腸黏膜蛋白的雙向凝膠電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)二者之間在表達上有明顯差異，差異表達蛋白質點數(shù)共26個差異點，其中在大腸癌組織中表達上調點11個，下調的點15個。共分析了10個差異蛋白點，在10個蛋白質點中有5個蛋白質點得到鑒定。結論是大腸癌原發(fā)灶和正常腸黏膜蛋白質組表達有顯著差異，HSP27蛋白、S100A9蛋白和GST-π蛋白表達上調，GRP75蛋白表達下調有可能與大腸癌發(fā)生相關。

關鍵詞： 大腸癌 蛋白質組學 差異表達

大腸癌是我國常見的惡性腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢，尤其是結腸癌發(fā)病率的增長速度迅猛。全球大腸癌的發(fā)病率在腫瘤中男性居第4位、女性居第3位，患病率居第2位[1]。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是決定大腸癌患者預后及生活質量的關鍵。為了深入研究大腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機制，強化大腸癌的防治效果，筆者采用蛋白質組學雙向凝膠電泳（2-DE）等研究方法，對比分析正常直腸黏膜、大腸癌原發(fā)灶組織中蛋白質的表達差異，分離、鑒定大腸癌發(fā)生的相關蛋白，研究其對大腸癌細胞生物學行為的影響，以期為篩選臨床腫瘤標志物和治療靶標提供依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1標本采集。實驗所用標本均取自湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，國家重點肛腸科經(jīng)病理確診的本病首診患者共10例，以及經(jīng)病理確診的正常成人直腸黏膜12例。

1.1.2試劑。IPG緩沖液pH3～10、24cm固相化pH梯度干膠條、2D Quant蛋白質定量試劑盒、考馬斯亮藍G-250，購自Amershan Pharmacia公司。

1.1.3儀器。IPGphor等電聚焦儀、Ettan DALT Ⅱ垂直電泳槽、Imagescanner掃描儀均為Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1組織蛋白樣品的制備。組織活檢樣本用生理鹽水反復沖洗，以去除血液及其他污染，稱取適量組織樣品與8倍體積的組織裂解液混合后，用研缽使組織充分研磨裂解，研磨過程中不斷加入液氮以避免蛋白降解，置于室溫下1小時，間斷渦旋混勻，然后于12000g、4℃離心1小時，吸取上清液即為組織的總蛋白質。2D Quant Kit定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.2.2二維凝膠電泳。操作步驟主要按照IPGphor等電聚焦系統(tǒng)使用指南進行。實驗重復3次。

1.2.3凝膠圖像分析。應用Imagescanner掃描儀及LabScan掃描軟件掃描考馬斯亮藍染膠獲取圖像，PDQuest 2-DE軟件比較分析健康人和大腸癌患者組織蛋白二維電泳圖譜的差異，選取表達水平相差 2倍以上的點作為后續(xù)質譜分析的候選蛋白質點。

1.2.4質譜分析。從膠中切取差異蛋白質點于1.5 ml Eppendorf管中，50%乙腈和100 mmol/L碳酸氫銨脫色30 min，乙腈脫水冷凍抽干。加入10 μl TPCK處理的胰蛋白酶（0.1 mg/L）冰上吸脹60 min，37℃酶解12 h，30 μl萃取液（100%乙腈∶5%甲酸1∶1）萃取60 min，重復萃取1次。將萃取液收集于0.5 ml Eppendorf管，冷凍濃縮至總體積2-5μl。制備好的樣品在MALDI-TOF-MS質譜儀中進行分析儀上進行分析。結果利用Mascot軟件檢索NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質。

2.結果

2.1兩組組織二維電泳圖譜的建立和圖像分析

應用2-DE技術分別分離12例健康人直腸黏膜和10例大腸癌患者癌組織的混合蛋白。考馬斯亮藍G-250染色后，得到了健康人和大腸癌患者組織的2-DE圖譜。為了保證結果的可靠性，在相同的條件下重復2-DE兩次，獲得兩組的2-DE圖譜各3張，采用PDquest圖像分析軟件對2-DE圖像進行分析。結果顯示：健康人組織平均蛋白質點數(shù)為1000±10，大腸癌組織平均蛋白質點數(shù)為1010±5，匹配率為（93.5±5.0）%。兩種組織樣本共有26個差異點，其中在大腸癌組織中表達上調點11個，下調的點15個。圖1為有代表性的大腸癌組織蛋白質的2-DE圖譜。

2.2差異蛋白質點的鑒定

從膠中切取較明顯的10個差異蛋白質點，進行MALDI-TOF-MS質譜分析。利用Mascot查詢NCBI數(shù)據(jù)庫，如果Mascot分數(shù)>56分（P<0.05）則認為得到鑒定，否則視為未得到鑒定。在10個蛋白質點中有5個蛋白質點得到鑒定，即HSP27蛋白，S100A9蛋白，GST-π蛋白，GRP75蛋白，Aldehyde dehydrogenase X蛋白。

3.討論

不同生物學特性的腫瘤細胞具有不同的發(fā)生、發(fā)展和特殊性狀，其中蛋白表達的差異起到了重要作用。腫瘤與正常組織或細胞的蛋白質表達譜差異分析是腫瘤蛋白質組學研究中應用最廣泛和最有效的手段[2，3]。本課題利用蛋白組學技術比較了大腸癌組織與正常直腸黏膜，發(fā)現(xiàn)了5種蛋白質的表達水平均發(fā)生了明顯變化，這些差異表達的蛋白有可能成為早期診斷大腸癌的候選標記物。本研究鑒定出的HSP27、Sl00A9和GST-π均可能與大腸癌的發(fā)生有關，可能作為大腸癌早期診斷的候選新型生物標志物及大腸癌治療的靶標，但這需要在以后的實驗中進一步證實。生物信息學分析表明，本研究篩選出的5種蛋白與細胞增殖、信號轉導通路、細胞周期調控等密切相關，可能在大腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而對這些蛋白的特性功能進一步分析研究可為探討大腸癌的分子機制、尋找大腸癌早期診斷的分子標記物提供實驗和理論依據(jù)。

參考文獻：

[1]Park in DM，Bray F，F(xiàn)erlay J，et al.G lobal cancer statistics[J].CA CancerJ Clin，2005，55（2）：74-108.

[2]Lawrie LC，F(xiàn)othergill JE，Murray GI.Spot the differences：proteomics in cancer research.Lancet Oncol，2010，2（11）：698.

[3]Simpson RJ，Dorow DS.Cancer proteomics：from signaling networks to tumor markers.Trends Biotechnol，2010，19（10 Suppl）：40.