李小橋 武 煊 李玉平 蘇亮

摘 要：建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定牛肉組織中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝達(dá)唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）殘留量的檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取柱凈化后，以C18反相色譜柱為分析柱，0.1%甲酸水-乙腈為流動(dòng)相，采用電噴霧電離源（ESI+），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，4種硝基咪唑類藥物響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度在1.00～25.00ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2在0.998 6以上；在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ、 MNZ、 RNZ和TNZ回收率在64.4%～96.6%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于15%；4種藥物檢測(cè)限（LOD）為0.1μg/kg，定量限（LOQ）為0.2μg/kg。方法滿足于牛肉中上述單種或多種種硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：UPLC-MS/MS；硝基咪唑類藥物；牛肉；殘留

中圖分類號(hào) S823 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1007-7731（2013）09-28-04

硝基咪唑類藥物（nitroimidazoles）是一類具有5-硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，包括甲硝唑（metronidazole，MNZ）、地美硝唑（dimetridazole，DMZ）、洛硝達(dá)唑（ronidazole，RNZ）和替硝唑（tinidazole，TNZ）等。該類藥物主要用于治療和預(yù)防厭氧菌引起的局部或系統(tǒng)感染，抑制厭氧菌的DNA合成，也用于抗滴蟲(chóng)和阿米巴原蟲(chóng)等。由于硝基咪唑類藥物含有的硝基雜環(huán)類化合物具有細(xì)胞誘變性，從而導(dǎo)致此類藥物有致癌作用和潛在的致畸作用[1-2]，因此硝基咪唑類藥物在大多數(shù)國(guó)家為禁止使用或允許使用但必須嚴(yán)格監(jiān)控的藥物[3-4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235公告中[5]，地美硝唑、甲硝唑在動(dòng)物中允許作治療用，但不得在動(dòng)物性食品中檢出藥物，洛硝達(dá)唑?yàn)榻故褂玫乃幬铮趧?dòng)物性食品中不得檢出，但替硝唑沒(méi)有明確的使用和殘留限量規(guī)定，因此，在實(shí)際生產(chǎn)中替硝唑有可能代替其他硝基咪唑類藥物應(yīng)用于獸醫(yī)臨床，存在潛在的毒副作用。

硝基咪唑類藥物的化學(xué)性質(zhì)較不穩(wěn)定，見(jiàn)光、遇熱易分解，檢測(cè)其在動(dòng)物性食品中的殘留較為困難。隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，質(zhì)譜法用于動(dòng)物性食品中藥物殘留檢測(cè)的報(bào)道越來(lái)越多，且能夠?qū)Υ龣z物進(jìn)行確證，常用的有液相色譜質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[6-8]和氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）或串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS/MS）[9]，由于氣相色譜質(zhì)譜法需要對(duì)極性、非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定的待檢化合物進(jìn)行衍生化，而且對(duì)衍生化條件要求十分嚴(yán)格，因此選用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)尤其是LC-MS/MS進(jìn)行動(dòng)物組織或產(chǎn)品中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)具有較大優(yōu)勢(shì)。目前，國(guó)內(nèi)外報(bào)道在豬組織、禽類組織、蜂蜜和飼料中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)方法較多，而對(duì)牛肉組織中硝基咪唑類藥物L(fēng)C-MS/MS檢測(cè)法報(bào)道較少，本試驗(yàn)旨在建立一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的測(cè)定牛肉中硝基咪唑類藥物殘留的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（UPLC-MS/MS）：TSQ ULTRAL，美國(guó)Thermo Scientific公司；色譜柱：Thermo Gold C18色譜柱（150mm×4.6mm，2.1μm），美國(guó)Thermo Scientific公司；電子天平：AE250，瑞士Mettler公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Laborota4000型，德國(guó)Heidolf公司；高速冷凍離心機(jī)：SIGMA 3K30，德國(guó)SIGMA公司；渦旋振蕩儀：SIR4，德國(guó)IKA公司；空氣搖床：KS260，德國(guó)IKA公司；氮吹儀：TTL-DCII型，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展公司。

地美硝唑、甲硝唑、洛硝達(dá)唑和替硝唑?qū)φ掌罚壕?gòu)自德國(guó)Dr Ehrenstorfer公司（4℃冷藏保存）；甲醇、乙腈：色譜純，均購(gòu)自德國(guó)SIGMA公司；無(wú)水硫酸鈉、正己烷、乙酸乙酯：分析純，均購(gòu)自重慶邁克公司；PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取小柱：60mg/3mL，北京迪馬科技有限公司。

牛肉樣品：采集于重慶某超市生鮮部。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液配制 精確稱取地美硝唑、甲硝唑、洛硝達(dá)唑和替硝唑?qū)φ掌犯?0.0mg，用甲醇定容至50mL，制成濃度為200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再精確量取1.0mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，定容至100mL，配成2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，標(biāo)準(zhǔn)工作液臨用時(shí)再逐級(jí)稀釋。

1.3 UPLC-MS/MS分析條件

1.3.1 液相條件 流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，梯度洗脫程序：0～1min，95%A線性變化至70%A；1～6min，保持70%A；6.0～6.1min，70%A線性變化至95%A；6.1～10min，保持95%A。流速：250μL/min；進(jìn)樣量：10μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件 監(jiān)測(cè)模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）模式；離子源：電噴霧電離源（ESI+）；噴霧電壓4.5kV；蒸發(fā)氣溫度：150℃；毛細(xì)管溫度：350℃；鞘氣：30L/H，輔氣：5L/H。4種硝基咪唑類藥物選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下參數(shù)見(jiàn)表1。

1.4 樣品處理

1.4.1 提取 稱?。?.00±0.05）g牛肉于50mL塑料離心管，加入無(wú)水硫酸鈉4g，再加入15mL乙酸乙酯，渦旋1min，振蕩10min后，6 000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，上清液轉(zhuǎn)移至100mL雞心瓶，殘?jiān)儆?5mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，于40℃水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用1mL甲醇、2mL 1%醋酸溶液和3mL正己烷溶解雞心瓶中殘留物，轉(zhuǎn)移至50mL塑料離心管，重復(fù)以上操作一次，合并2次溶液，渦旋振蕩2min，3 000r/min轉(zhuǎn)速下離心5min，棄掉正己烷層，下層溶液中再加入6mL正己烷重復(fù)除脂一次，最后在下層溶液中加入6mL去離子水混勻，備用。

1.4.2 凈化 依次用3mL甲醇和3mL水活化SPE小柱，將上述備用液全部轉(zhuǎn)移上柱，流速不超過(guò)1mL/min，再用3mL水和2%甲醇溶液淋洗SPE小柱，擠干，用5mL甲醇洗脫，收集洗脫液，40℃下氮?dú)獯蹈桑?mL流動(dòng)相（5%乙腈-0.1%甲酸溶液）定容，取10μL上超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取與凈化條件優(yōu)化 硝基咪唑類藥物見(jiàn)光、遇熱易分解，整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程要求在避光、較低溫度下快速完成。對(duì)于動(dòng)物組織中硝基咪唑類藥物殘留而言，常用的提取溶劑有乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲苯、鹽酸等[10-11]。由于二氯甲烷和甲苯有較強(qiáng)的毒性，本試驗(yàn)選擇乙腈和乙酸乙酯進(jìn)行了比較，二者提取回收率相當(dāng)，但是相對(duì)于乙酸乙酯，乙腈提取動(dòng)物組織時(shí)會(huì)提取更多極性基質(zhì)[10-11]，且乙腈提取液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)過(guò)程中容易沸騰，操作較難控制，而乙酸乙酯沸點(diǎn)較低，提取液在較低溫度下也能快速蒸發(fā)至干，因此本試驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為提取溶劑。

硝基咪唑類藥物在酸性環(huán)境下呈離子狀態(tài)，易容于水溶液，而在堿性環(huán)境下呈分子狀態(tài)，易溶于有機(jī)溶劑[12]，因此其凈化過(guò)程可以選擇液液萃取除脂，本試驗(yàn)選擇醋酸溶液和甲醇復(fù)溶雞心瓶殘留物，再用正己烷除脂；另外，本試驗(yàn)過(guò)程中還篩選了SCX強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱、PLS親水親酯平衡柱和C18等固相萃取柱進(jìn)行凈化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用SCX柱時(shí)，地美硝唑、甲硝唑和洛硝達(dá)唑回收率只能達(dá)到40%～50%，而C18柱對(duì)甲硝唑保留效果也不太理想，平均回收率不到60%，但是PLS柱能提高甲硝唑平均回收率到70%左右，其它硝基咪唑類藥物均能達(dá)到80%～95%，因此本試驗(yàn)選取PLS親水親酯平衡柱進(jìn)行凈化。試驗(yàn)還對(duì)4種藥物在樣品中基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了研究，分別向空白樣品基質(zhì)溶液和流動(dòng)相中添加4種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成相同濃度樣品各5份，上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)，分別比較4種藥物的響應(yīng)值，結(jié)果表明，在兩種基質(zhì)中差異不明顯，因此可以忽略基質(zhì)效應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

2.2 檢測(cè)條件的優(yōu)化 試驗(yàn)選擇甲醇-甲酸水體系和乙腈-甲酸水體系作為流動(dòng)相進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用甲醇-甲酸水體系時(shí)，在Thermo Gold C18色譜柱上，4種硝基咪唑類藥物完全不能分開(kāi)，后者能完全分離4種目標(biāo)化合物（見(jiàn)圖1），因此本方法選擇乙腈-甲酸水作為流動(dòng)相。

DMZ、MNZ、RNZ和TNZ化合物在ESI+模式下響應(yīng)很高，都以[M+H]+形式分別形成其質(zhì)子化分子離子。再對(duì)其質(zhì)子分子離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，結(jié)果表明，對(duì)于DMZ，分子離子電離失去NO2得到其主要離子碎片m/z=96.2；MNZ分子離子電離失去CH2CHOH得到其主要離子碎片m/z=128.1；RNZ失去HOCONH2得到m/z=140.2主要離子碎片；TNZ分子離子電離丟失5-硝基咪唑環(huán)得到m/z=121.1主要離子碎片（見(jiàn)表1）。最后對(duì)4種藥物的8個(gè)離子對(duì)在SRM選擇離子監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行優(yōu)化，選擇響應(yīng)值最高時(shí)的碰撞能和透鏡電壓（見(jiàn)表1）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限與定量限

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將1.2中2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋成濃度為1、2、5、10、20和25μg/L，在1.3 UPLC-MS/MS分析條件下測(cè)定，以各種藥物特征離子質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，4種硝基咪唑藥物在1.00～25.00μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程、相關(guān)系數(shù)（見(jiàn)表2）。

2.3.2 檢測(cè)限與定量限 采用在空白樣品中添加4種硝基咪唑類藥物的方法，依據(jù)特征離子色譜峰信噪比S/N>3為方法檢測(cè)限（LOD），S/N>10為方法定量限（LOQ），測(cè)得4種硝基咪唑類藥物檢測(cè)限為0.1μg/kg，定量限為0.2μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度 在空白牛肉中加入由2μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成10、50和100μg/L的工作液各100μL（添加水平相當(dāng)于0.2、1、2μg/kg），按1.4進(jìn)行前處理，1.3條件進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)每個(gè)加標(biāo)水平做5個(gè)平行試驗(yàn)，重復(fù)3次，計(jì)算回收率和批內(nèi)、批間變異系數(shù)，分別考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。

結(jié)果表明，在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下DMZ平均回收率分別是84.9%、91.2%和90.1%，MNZ平均回收率分別是67.5%、73.8%和75.5%，RNZ平均回收率分別是81.5%、84.0%和85.0%、TNZ平均回收率分別是94.2%、93.1%和94.7%，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于15%，說(shuō)明本方法準(zhǔn)確度和精密度較高，滿足于牛肉中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)要求?；厥章式Y(jié)果見(jiàn)表3。

3 結(jié)論

本文建立了牛肉中地美硝唑（DMZ）、甲硝唑（MNZ）、洛硝達(dá)唑（RNZ）和替硝唑（TNZ）的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法殘留檢測(cè)方法。樣品經(jīng)乙酸乙酯提取，正己烷除脂，PLS（親水親脂平衡柱）固相萃取柱凈化，采用電噴霧電離源（ESI+），選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（SRM）進(jìn)行檢測(cè)。4種硝基咪唑類藥物在0.2、1.0和2.0μg/kg添加水平下的回收率在64.4%～96.6%范圍內(nèi)，批內(nèi)、批間變異系數(shù)小于15%，檢測(cè)限（LOD）為0.1μg/kg，定量限（LOQ）為0.2μg/kg，結(jié)果表明該方法穩(wěn)定可行、靈敏度高，且分析過(guò)程簡(jiǎn)單快速，適用于牛肉中硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]汪紀(jì)倉(cāng)，王大菊，林霖，等. 硝基咪唑類藥物殘留檢測(cè)方法研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)獸藥雜志，2007，41（8）：31-33.

[2]沈建忠，項(xiàng)新華，張躍，等. 家禽肌肉組織中硝基咪唑類藥物高效液相色譜檢測(cè)法研究[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（6）：700-703.

[3]DOMNIQUE H P，BERNARD D，MICHEL L. Determination of four nitrioinidzole residuces in pourltry meat by liquid chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，2000，882：89-98.