王曉敏 侯占銘

摘 要： 基因敲除（gene knock-out）又稱基因打靶，是通過外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進行精確的定點修飾和基因改造，具有專一性強、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點。2007的諾貝爾得獎項目就是用胚胎干細胞在小鼠特性基因修飾技術中的重大成就。這個重大獎項的頒發(fā)，使基因敲除這項高科技更加全面地展現(xiàn)在世人面前。這項技術從20世紀70年代一直發(fā)展至今，對人類作出了一定的貢獻，但是由于技術要求比較高，因此還有很多缺點需要科學家共同努去克服，使其能在各個方面為人類作出更大的貢獻。從基因敲除技術的發(fā)展趨勢來看，它的前景會越來越廣闊。

關鍵詞： 基因敲除 胚胎干細胞 同源重組

2007年10月8號，諾貝爾生物或醫(yī)學獎頒發(fā)，得獎者是美國遺傳學家馬里奧·卡佩奇安德（Mario R.Capechiand）、奧利弗·史密塞斯（Oliver Smithies）和英國遺傳學家馬丁·埃文斯（Martin J.Evans）。得獎項目就是他們用胚胎干細胞在小鼠特性基因修飾技術中的重大成就?？ㄅ迤姘驳乱驗樵凇盎虼虬小钡募夹g研究上有突破性工作而聞名世界，幾乎同時史密塞斯也對此技術作出了巨大的奠基性的貢獻，埃文斯是世界上最先從小鼠體內(nèi)分離出胚胎干細胞，從而促進應用“基因敲擊小鼠”技術的科學家。由這一重大創(chuàng)舉，許多科學家和未來學家這樣預言：21世紀將是生命科學的世紀，在此基礎上，醫(yī)學也將迅猛發(fā)展。1990年人類基因組計劃啟動，同時包括了人類基因圖譜的繪制，隨著這個偉大計劃的完成，對未知基因的功能探索和研究將成為21世紀的熱點領域，一些動物模型和其他模式生物將成為研究基因功能的工具。

1.基因敲除的基本原理

在早期的一些生理學的研究中，科學家們?yōu)榱四茉敿毩私鈩游锬骋黄鞴俚哪骋徊糠值木唧w功能，采用器官切除的方法，也就是將實驗動物需要研究的器官或部分切除，之后觀察實驗動物的某些生理生化指標與功能的改變，從而判斷這個器官或部分的具體功能，指標異常和生理缺陷的具體表現(xiàn)就是被切除組織的功能。[1]在現(xiàn)如今分子水平如此發(fā)達的今天，對于一個已知結(jié)構而功能卻未知的基因，我們用類似的方法進行此基因的功能研究，即將某一基因或一部分切下，然后觀察被實驗動植物的狀態(tài)、表型和其他性狀的變化判斷基因的具體功能。這種最新的研究基因功能的方法就是基因敲除（knock out）。經(jīng)典遺傳學（Forward genetics）是從一個突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進而找出該基因的編碼序列，而現(xiàn)代遺傳學（Reverse genetics，反向遺傳學）首先從基因序列出發(fā)，推測其表現(xiàn)型，進而推導出該基因的功能?；蚯贸纸谢虼虬?，是將一段無關的DNA片段用來取代某一特定的基因，也是最簡便的令基因失活的方法，是揭示基因功能最直接的手段之一?；蚯贸幕驹硎窃谝欢螣o關片段的兩側(cè)連接與代換基因兩側(cè)相同的序列，將這一構建導入目的細胞，然后基于同源重組（homologous bination）的機制，可使無關片段取代靶基因整合到染色體中。同源重組是指發(fā)生在非姐妹染色單體（sister chromatin）之間或同一染色體上含有同源序列的DNA分子之間或分子之內(nèi)的重新組合，[2]這種現(xiàn)象普遍存在于噬菌體、細菌和真核生物中。

為了便于敲除之后的篩選，用于取代靶基因的外源DNA中都含有報告基因，一般都是選用抗生素的抗性基因，在其兩側(cè)連接同源重組序列后就組成一個“缺失盒框”（deletion cassette）。基因敲除可以改變原基因組的組成，使其產(chǎn)生不同的生物效應，在一定程度上終止原基因的表達。在某些時候，也會有這種情況的發(fā)生，就是用正常的基因敲除突變基因，這樣做有可能使原來突變的某基因轉(zhuǎn)變?yōu)樵嫉囊吧汀3—4]總之，基因敲除是一門精細的修飾與改造真核生物基因組的新技術。[3]基因敲除從20世紀80年代發(fā)展至今，已經(jīng)經(jīng)歷過很多次的技術更新，從一開始最簡單的完全敲除發(fā)展到現(xiàn)如今的條件敲除，慢慢地向著更有難度的特定組織基因敲除、特定時間基因敲除的可調(diào)控敲除方向發(fā)展。[5]完全基因敲除是指通過同源重組法完全消除細胞或者動物個體中的靶基因活性，而條件型基因敲除是指將某個基因的修飾限定于特定類型的細胞或個體發(fā)育特定的階段，即通過定位重組系統(tǒng)實現(xiàn)特定時間和空間的基因敲除。

2.基因敲除的技術路線

真核生物基因敲除的技術路線主要包括構建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導入胚胎干細胞中，使外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達。

從動物的角度來講，老鼠是一種廣泛應用于實驗及科研的模式生物，因為老鼠的基因組組成與人類基因組的組成極為類似。與酵母不同，老鼠是多細胞生物，基因的功能常常與生長發(fā)育有關，具有組織專一性。若要觀察并得知某一基因的表型，則需要獲得老鼠的完整個體，科學家們經(jīng)過多年的實驗與研究，終于解決了這一問題。解決方法就是利用一類特殊的老鼠細胞，就是我們所知的胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES細胞）。ES細胞不同于一般的老鼠細胞，它是從哺乳動物早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生的內(nèi)胚團（inner cell mass）中分離出來的。胚胎干細胞本身是二倍體，而且能在體外培養(yǎng)，具有高度的全能型，即潛在的可分化為所有類型細胞的能力，形成包括生殖細胞在內(nèi)的所有組織，并且在不同的培育條件下表現(xiàn)出不同的功能狀態(tài)。[4]將缺失代換獲得的ES細胞注射到老鼠胚細胞中，使之混合成為嵌合體，胚細胞繼續(xù)發(fā)育長成的小老鼠也是嵌合體。然后將嵌合體的老鼠互相交配，從其子代中可獲得基因型純合的缺陷個體。這些老鼠個體的每個細胞都攜帶失活的基因，稱其為剔除老鼠（knock-out mice）。通過觀測剔除老鼠的表型即可獲知失活基因相關功能的信息。該項技術適用于許多基因的功能檢測，但有些基因的缺陷在純合時是致死的，此時實驗程序要做出相應的修改?？蓪⒂腥毕莸那逗象w老鼠與正常老鼠交配，生下幼崽后，有缺陷的雜合老鼠的表型仍舊會表現(xiàn)得有些異常，可據(jù)此再重新分析缺陷基因的功能。胚胎干細胞（ES細胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動物基因敲除的技術基礎。

從植物方面講，擬南芥是最常用的模式生物之一。隨著擬南芥的模式植物的基因組序列測定的完成，這些基因的功能研究就被提上日程。擬南芥作為模式植物，是世界上第一個完成基因測序的開花植物，但這些基因中有高達90%以上的基因是未知功能的，這就需要用反向遺傳學來逐一鑒定這些基因各自的功能。[6]T-DNA插入失活技術是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段?；驹砭褪抢酶┺r(nóng)桿菌T-DNA介導轉(zhuǎn)化，將帶有報告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會影響該基因的表達，從而使該基因“失活”。具體過程是首先將目的基因與啟動子（花椰菜病毒35S）及終止子組成嵌合DNA分子，接著將這個嵌合DNA分子插入到Ti衍生質(zhì)粒RB與LB內(nèi)，使其構成重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細胞，還要利用重組的農(nóng)桿菌細胞感染植物，目的是將質(zhì)粒部分DNA包括目的基因整合到植物染色體中實現(xiàn)最終遺傳轉(zhuǎn)化。使用T-DNA插入突變可以直接在基因組DNA中產(chǎn)生穩(wěn)定的插入突變，而不需要使用額外的步驟穩(wěn)定。有研究表明，T-DNA標簽在擬南芥中的分布并非是完全隨機的，而是有一定的偏向性，但這種分布的偏向性并不影響利用T-DNA插入突變來飽和基因組。有的時候，T-DNA有一些缺點，例如這種方法只適用于部分植物，而這些植物是容易被T-DNA轉(zhuǎn)化的才可以。再例如T-DNA整合還能出現(xiàn)一些復雜情況，有時還會引起染色體重排的現(xiàn)象，使得實驗后續(xù)的結(jié)果分析變得艱難。盡管有這樣那樣的缺點，農(nóng)桿菌介導的T-DNA轉(zhuǎn)化擬南芥的方法還是得到了極大的推廣和發(fā)展。

3.基因敲除的發(fā)展過程

基因敲除技術最早是于20世紀70年代發(fā)展起來的，最早的研究對象被定為酵母細胞。開始是將大多數(shù)的外源DNA片段通過同源重組整合到基因組內(nèi)，隨機插入僅占小部分，多為同源位點整合。在科學家們的共同努力下，于80年代的早期，基因敲除漸漸發(fā)展到了哺乳動物細胞。自從1981年小鼠的胚胎干細胞被美國和英國的兩位科學家成功地分離出來后，胚胎干細胞基因敲除的技術就慢慢發(fā)展起來，并被廣泛利用，日趨成熟。1984年，Bradly等把從小鼠體內(nèi)分離出來的胚胎干細胞株移植入胚泡腔，這個實驗首次證實了從小鼠體內(nèi)分離出來并在體外培育的ES細胞是能夠在母鼠體內(nèi)發(fā)育成生殖嵌合體的，也能在適當交配后得到純合體子代。在1985年，Smithies等首次成功利用基因敲除技術證實了利用同源重組對生物體的遺傳信息進行定向改造的可能性。[7]1987年，Thomas等選擇了X連鎖的hprt基因作為靶基因，首次在胚胎干細胞中實現(xiàn)了基因敲除。同一年，也有被稱為早期基因敲除經(jīng)典實驗之一的小鼠hprt基因的定點突變。1989年，真正的基因敲除小鼠誕生。[8]到了20世紀90年代后，基因敲除技術發(fā)展更迅速，多種方法手段應運而生，得到了更多的應用，使基因敲除在生物技術領域的地位更加穩(wěn)固。

4.基因敲除的優(yōu)點與缺點

基因敲除既然能被選作為2007年的諾貝爾獎，自然說明這項技術有一定的優(yōu)點。其一，基因敲除這項技術的適用范圍很廣，既可以是原核細胞，又可以是真核細胞，不過較多的時候，這項技術還是被用在真核生物的研究上。其二，基因敲除發(fā)展至今已經(jīng)相對成熟，也是目前能精確修飾基因組的一個有效方法。人們可以按照自己設計好的實驗方法對一些結(jié)構極其復雜的細胞基因組進行定點、定量的改變，從而達到自己的目的，也就是定向地改變實驗對象的遺傳結(jié)構和特征，經(jīng)過實驗證明，這些被改造過的基因是可以隨染色體DNA復制而穩(wěn)定復制的，也就是說這些基因所表達出來的性狀是可以穩(wěn)定遺傳的。其三，和其他手段相比更安全。

科學不斷進步，如此先進的技術肯定會有自身的不足之處。這種技術命中率低，操作較為復雜，實驗周期長，所用藥品或其他儀器費用偏高；因為基因功能未知，所以在實驗研究的過程中，敲除掉了一些有特殊功能的基因，而若這些基因一旦不存在，細胞就會死亡，這些致死基因就無法研究；有些基因的功能很復雜，當它被敲除掉時，原本是要觀察表型判斷功能，卻會由于此基因功能的復雜性而沒能形成容易識別的表型，又或者是其他沒被敲除的基因也有和被敲除基因同樣的功能，而使表型變化不明顯，導致研究進行不順利；實驗易受非同源重組隨機插入的干擾，等等。這些不足說明，基因敲除技術雖已發(fā)展較為成熟，但科學家們需要進一步努力，使之更加完善。

5.基因敲除的應用

5.1在培育動植物方面的應用

基因敲除技術已經(jīng)在動植物身上有了研究成果，現(xiàn)已可用基因敲除技術使一些轉(zhuǎn)基因動植物的生產(chǎn)性能、抗病力等獲得重大的提高，為人類提供所需要的優(yōu)良品種。

5.2在醫(yī)學方面的應用

現(xiàn)階段人類對很多疾病還是束手無策，而基因各項技術的逐步發(fā)展都是非常漫長的，需要科學家的努力，所以在這個過程中，人類疾病的動物模型就顯得非常重要，若將這些實驗結(jié)果慢慢作用于人類身上，則為人類的各種疾病獲得更好的治療是指日可待的。

5.3在食物方面的應用

基因敲除技術在動植物，尤其是食用性的植物或動物身上的研究結(jié)果，都是為了獲得某型更優(yōu)良的性狀，可以為人類提供更優(yōu)質(zhì)的食物。

5.4在微生物育種方面的應用

近些年來，微生物在解決人類糧食、能源、健康和環(huán)境保護等方面問題的作用越來越重要，但隨著社會進步和科技發(fā)展，微生物育種遇到了很多難題，而基因敲除技術已在這個領域被廣泛應用。具體應用于構建具有特定突變的工程菌，改變生物代謝途徑，阻斷副反應的進行，防止副產(chǎn)物或有毒產(chǎn)物的形成，等等。[9]

6.基因敲除的前景

基因敲除技術從20世紀70年代發(fā)展至今，在很多領域已經(jīng)占據(jù)了其他技術不能取代的地位，其克服了隨機整合的盲目性和偶然性，是一種理想的修飾和改造基因的方法。它有廣闊的發(fā)展前景，這就需要科學家們共同努力。人類基因組計劃的啟動，包括人類基因圖譜的繪制完成，人類對未知基因的功能探索和研究將成為21世紀的熱點領域，這項技術會越來越成熟，會對全人類作出更多更大的貢獻。

參考文獻：

[1]劉德培，方福德，梁植權.基因敲除[J].生理科學進展，1995（01）.

[2]黃敏.基因敲除技術及其應用[J].廣東輕工職業(yè)技術學院學報，2009（04）.

[3]王向東，童坦君.基因打靶及其應用[J].生物化學與生物物理進展，1996（06）.

[4]石東喬.“基因敲除”研究進展[J].自然雜志，1996（01）.

[5]李今煜，陳健銘，彭振坤.幾種常見的基因敲除技術[J].武夷科學，2007（00）.

[6]陳其軍，肖玉梅，王學臣等.植物功能基因組研究中的基因敲除技術[J].植物生理學通訊，2004（01）.

[7]田三德，孫鵬.基因打靶技術及其應用[J].陜西科技大學學報，2003（04）.

[8]詹振宏，吳偉偉，田月珍等.基因打靶技術的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī)，2011（02）.

[9]張紅巖，申乃坤，周興.基因敲除技術及其在為生物育種中的應用[J].釀酒科技，2010（04）.

通訊作者：王曉敏