劉繼科等

摘 要：研究構(gòu)建人基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）的原核表達(dá)載體，并進(jìn)行原核表達(dá)獲得重組蛋白MMP-7。以人腎腫瘤組織總RNA為模板，PCR方法獲得MMP-7成熟蛋白的基因序列，構(gòu)建含10xhis標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），并經(jīng)異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組蛋白，并經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），檢測其表達(dá)情況。最終得到pET24a（+）-MMP-7-10his重組質(zhì)粒，誘導(dǎo)表達(dá)后重組蛋白占總蛋白的41%左右，獲得21.2kD大小蛋白，與目的蛋白大小一致，純度大于90%，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：基質(zhì)金屬蛋白酶-7；基因克隆；原核表達(dá)

中圖分類號 Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）07-31-04

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一類依賴Zn2+的參與ECM降解的蛋白水解酶，可降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellar matrix， ECM）的大多數(shù)蛋白質(zhì)，并參與調(diào)節(jié)ECM動態(tài)平衡，是維持ECM穩(wěn)態(tài)最重要的一類酶，其與機(jī)體許多病理過程密切相關(guān)[1-2]。在血管形成、炎癥、風(fēng)濕活動、胚胎發(fā)生、纖維化及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等生物體內(nèi)的生理及病理過程中的研究顯示，這些生理及病理過程中伴隨有MMPs的表達(dá)量上升[3-7]。

自1962年，Gross和Lapiere在蝌蚪尾巴組織發(fā)現(xiàn)間質(zhì)膠原酶（即MMP-1）[8]，其后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的MMPs被依次按發(fā)現(xiàn)時間順序命名，至今至少已發(fā)現(xiàn)人源MMP23種，包括膠原酶、明膠酶、基質(zhì)降解素、膜型MMPs和其他共五大類。其中基質(zhì)金屬蛋白酶7（MMP-7）屬基質(zhì)溶解素（Matrilysin），與腫瘤發(fā)生、細(xì)胞凋亡和血管形成等病理過程聯(lián)系密切[9]，是近年來的研究熱點。本研究利用基因工程技術(shù)，通過基因克隆，構(gòu)建基質(zhì)金屬蛋白酶7成熟蛋白原核表達(dá)載體，并進(jìn)行原核表達(dá)以獲得高純度重組蛋白，可以為進(jìn)一步研究MMP及各種機(jī)體的病理相關(guān)性提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 載體pET24a（+），菌株E.coli DH5a和BL21（DE3）均為本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 人腎腫瘤組織總RNA購自Biochain，內(nèi)切酶Nde I、BamH I、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶以及T載體pMD18-T simple購自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒購自羅氏，引物合成和測序由英駿生物技術(shù)有限公司提供，其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 MMP-7基因克隆 根據(jù)GeneBank中MMP-7成熟蛋白的基因編碼序列信息，采用軟件Primer Premier5設(shè)計引物S1/A1（引物序列見表1）。以人腎腫瘤組織總RNA為模板，按羅氏的反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA合成試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實驗，合成cDNA，并以其為模板擴(kuò)增目的基因。

RT-PCR程序為：65℃，10min、55℃，30min、85℃，5min。

PCR程序為：94℃預(yù)變性5min；以94℃，30s、52℃，30s、72℃，1min為循環(huán)條件，30個循環(huán)；72℃，10min。

1%凝膠電泳鑒定條帶大小，應(yīng)為519bp，PCR鑒定為陽性的話，純化回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T simple載體中得到pMD-MMP-7質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，PCR鑒定，結(jié)果為陽性后送測序。

1.2.2 pET24a（+）-MMP-7-10his原核表達(dá)載體的構(gòu)建 設(shè)計引物A2/A3和引物S2（引物序列見表1），上游引物S2的5端攜帶Nde I酶切位點，下游引物A3的5端引物攜帶BamH I酶切位點，和編碼10xhis標(biāo)簽和兩個終止密碼子的序列。以pMD-MMP-7質(zhì)粒為模板，S2/A2為引物進(jìn)行PCR應(yīng)得到551bp片段，再將其純化后作為模板，以S2/A3為引物進(jìn)行PCR應(yīng)得到578bp片段。1%凝膠電泳鑒定條帶大小，應(yīng)為578bp，PCR鑒定為陽性的話，純化回收PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T simple載體中，轉(zhuǎn)化到E.coli DH5a克隆菌株中，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，PCR鑒定，結(jié)果為陽性后送測序。

PCR程序分別為：94℃預(yù)變性5min；以94℃，30s、55℃，30s、72℃，1min為循環(huán)條件，30個循環(huán)；72℃，10min。

94℃預(yù)變性5min；以94℃，30s、60℃，30s、72℃，1min為循環(huán)條件，30個循環(huán)；72℃，10min。

用Nde I和BamH I分別酶切MMP-7的578bp目的片段和pET24a（+）表達(dá)載體，產(chǎn)物凝膠純化回收，用T4連接酶做連接反應(yīng)，得到pET24a（+）-MMP-7-10his原核表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化E.coli DH5a菌株，提取轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，PCR鑒定，結(jié)果為陽性后送測序。原核表達(dá)載體pET24a（+）-MMP-7-10his的構(gòu)建如圖1所示。

1.2.3 pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）重組表達(dá)菌的構(gòu)建及鑒定 將測序結(jié)果正確的陽性重組質(zhì)粒pET24a（+）-MMP-7-10his轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)，得到重組表達(dá)菌pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3），將轉(zhuǎn)化的重組表達(dá)菌株pET24a（+）-MMP-7-10his/BL21（DE3）涂固體培養(yǎng)平板（卡那抗性），37℃培養(yǎng)過夜，挑5個單克隆，分別接種到5mL TB液體培養(yǎng)基（卡那抗性），37℃，250rpm/min條件下培養(yǎng)6h，使菌液OD600=0.6～0.8，加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度為0.4mmol/L誘導(dǎo)，37℃，200rpm/min條件下培養(yǎng)4h，4℃，6 000rpm/min離心5min，收集菌體，菌體加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸10min，15%SDS-PAGE檢測各菌株表達(dá)情況。

1.2.4 MMP-7蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析 活化高表達(dá)菌株，按1：50轉(zhuǎn)接到10mL TB液體培養(yǎng)基中（卡那抗性），搖床培養(yǎng)2h，加入IPTG至終濃度0.4mmol/L，在37℃條件下，250rpm/min培養(yǎng)4h，誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。取1mL表達(dá)菌液，12 000rpm，5min離心，收集菌體，PBS洗滌兩次后，1mL PBS重懸，做冰浴超聲3min（200W，超聲5s，間歇5s），破碎細(xì)胞，澄清液于4℃、12 000rpm/min離心5min，SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀。

2 結(jié)果與分析

2.1 MMP-7基因克隆與重組表達(dá)載體構(gòu)建 以人腎總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄后，PCR獲得目的基因片段，此研究中分別以S1/A1、S2/A2和S2/A3為引物經(jīng)多次PCR，最終得到的PCR產(chǎn)物片段為578bp，與預(yù)測大小一致，包含測序正確的MMP-7基因序列，以及設(shè)計的10xhis標(biāo)簽序列，經(jīng)雙酶切后連接構(gòu)建正確的重組表達(dá)載體pET24a（+）-MMP-7-10his，PCR及測序結(jié)果顯示其構(gòu)建正確（圖1、2）。

測序結(jié)果如圖4，其中下劃線序列為酶切位點序列，粗體部分為10xHis序列及雙終止子，方框內(nèi)為載體序列，其余序列是MMP7序列，與目標(biāo)序列完全重合。

2.2 重組表達(dá)菌的構(gòu)建及鑒定 表達(dá)菌株的表達(dá)量可能存在差異，所以在表達(dá)時，選取高表達(dá)菌株有利于后面的表達(dá)。陽性克隆轉(zhuǎn)化BL21（DE3）后涂卡那抗性抗性平板篩選，挑5個克隆與液體抗性培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，并經(jīng)15%SDS-PAGE檢測各菌株重組蛋白表達(dá)顯示，結(jié)果顯示，各菌株在預(yù)期蛋白大小帶處均有表達(dá)，且其菌株表達(dá)量大致相當(dāng)（圖5）。

2.3 MMP-7蛋白誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析 菌株經(jīng)液體抗性培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)，取菌液離心，收集菌體，破碎細(xì)胞，澄清液離心后，SDS-PAGE電泳分析上清和沉淀以鑒定MMP-7蛋白表達(dá)和得到可溶性分析結(jié)果。結(jié)果顯示誘導(dǎo)表達(dá)后重組蛋白占總蛋白的41%左右，獲得21.2kD大小蛋白，與目的蛋白大小一致，純度大于90%，為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)（圖6）。

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶廣泛參與機(jī)體的生理病理過程，尤其是關(guān)于基質(zhì)金屬蛋白酶與各類腫瘤發(fā)生及演變的關(guān)系的研究顯示，在腫瘤發(fā)生演變過程中，往往伴隨基質(zhì)金屬蛋白酶的過量表達(dá)并參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移等演變進(jìn)程。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的研究顯示其具有抗腫瘤、治療心血管疾病、治療炎癥等生物活性。其中在抗腫瘤領(lǐng)域，相對于細(xì)胞毒試劑治療等傳統(tǒng)方法，以基質(zhì)金屬蛋白酶為藥物靶點，選擇其拮抗藥物成為新型的理想抗腫瘤方法。原核表達(dá)系統(tǒng)具有操作簡單、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點，構(gòu)建重組蛋白原核表達(dá)載體，利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，可快速獲得較大量的重組蛋白。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)，同時為了更有利于后期的純化，通過引物設(shè)計，在表達(dá)載體中設(shè)計加入10xhis序列和雙終止子序列，10xhis序列的加入使得重組蛋白帶有高親和標(biāo)簽，有利于蛋白純化，且標(biāo)簽分子量小，對蛋白結(jié)構(gòu)功能影響小，而加入的雙終止子序列則保證在加入標(biāo)簽時MMP-7重組蛋白更接近原始大小，利于后期的研究，最終經(jīng)高表達(dá)的原核表達(dá)后，獲得了高蛋白表達(dá)量和高純度的重組人MMP-7蛋白。但原核表達(dá)也存在表達(dá)蛋白易以包涵體形式存在的缺點，本研究表達(dá)的MMP-7重組蛋白即為包涵體，筆者嘗試多次復(fù)性，均不是很理想，有待于進(jìn)一步的研究。本研究有利于MMP-7和各種機(jī)體病理相關(guān)性的進(jìn)一步研究，而MMP及其抑制劑的研究也日趨熱門，相信隨著相關(guān)研究的不斷深入，人們將在腫瘤生物學(xué)和腫瘤治療等一些方面做出更大的成就。

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（責(zé)編：徐世紅）