高能 姚強(qiáng) 宮志遠(yuǎn)等

作者簡(jiǎn)介：高 能（1986-），女，碩士研究生，主要從事食用菌栽培、遺傳育種及食用菌病害研究。

通訊作者，E-mail：sdgzy2656@126com

摘要：采用CTAB結(jié)合DNA凝膠回收試劑盒法提取四種主要食用菌病害組織樣品的宏基因組DNA，用16S rDNA和18S rDNA通用引物分別對(duì)樣品的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化并進(jìn)行單克隆測(cè)序。每對(duì)引物隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆的rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，并對(duì)病害微生物的親緣關(guān)系進(jìn)行了初步分析，結(jié)果表明四種病害樣品中兩種為細(xì)菌性病害，兩種為真菌性病害。

關(guān)鍵詞：免培養(yǎng)；食用菌病害；rDNA 序列分析

中圖分類號(hào)：Q789 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）06-0011-05

食用菌病害研究的傳統(tǒng)檢測(cè)方法主要包括分離、純化、顯微觀察、染色技術(shù)、生理生化測(cè)定等[1]，所需時(shí)間長(zhǎng)，準(zhǔn)確性較低，往往需要結(jié)合其他鑒定技術(shù)（如PCR等分子技術(shù)）來(lái)提高其準(zhǔn)確性。

自Pace等[2]首次提出環(huán)境宏基因組學(xué)、Handelsman等[3]提出基因組的定義以來(lái)，宏基因組學(xué)已作為新的分子生物學(xué)方法，成功應(yīng)用于土壤[4]、海洋[5]環(huán)境微生物及消化道等菌群[6，7]的多樣性研究中。宏基因組技術(shù)是以樣品中的微生物群體總基因組作為研究對(duì)象，利用測(cè)序分析等生物信息學(xué)方法，基于非培養(yǎng)方式進(jìn)行微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系等的研究。本試驗(yàn)基于免培養(yǎng)技術(shù)直接提取病害樣品的宏基因組DNA，以16S rDNA/18S rDNA為靶基因進(jìn)行病害微生物鑒定及親緣關(guān)系初步分析，為食用菌病害的分子檢測(cè)方法研究提供了依據(jù)。

1 材料與方法

11 試驗(yàn)材料

111 材料 樣品1為平菇黃腐病病樣（PG，圖1A），采自濟(jì)南平陰縣孔村鎮(zhèn)食用菌基地；樣品2為雙孢菇褐斑病病樣（SBG，圖1B），采自菏澤市定陶縣馬集鄉(xiāng)牛楊村雙孢菇種植基地；樣品3為雞腿菇黑頭病病樣（JTG，圖1C），采自濟(jì)南平陰縣孔村鎮(zhèn)食用菌基地；樣品4為金針菇疑似胡桃肉狀菌病病樣（JZG，圖1D），采自濟(jì)南遙墻食用菌種植基地。

112 試劑 CTAB、Tris堿、EDTA、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、Taq PCR Master Mix、SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒等分子試劑，均購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

113 引物 細(xì)菌16S rDNA通用引物[8]：XF： 5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′，XR： 5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′；真菌18S rDNA通用引物[9]：ZF： 5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′，ZR： 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′；pUCm-T載體引物：TF： 5′-GTTGTAAAACGCAGGCCAG-3′，TR： 5′-CAGGAAACAGCTATGA-3′。引物合成及基因測(cè)序均由上海生工生物工程有限公司完成。

12 試驗(yàn)方法

121 總基因組DNA提取 將所采集樣品的病害部位分離備用，采用CTAB結(jié)合DNA凝膠回收試劑盒法提取基因組DNA[10]。

122 PCR擴(kuò)增及純化 分別利用16S rDNA/18S rDNA通用引物對(duì)各個(gè)樣品總基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系按照試劑盒說(shuō)明。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，50～55 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。并將其產(chǎn)物純化，具體步驟參照試劑盒使用說(shuō)明。

123 連接轉(zhuǎn)化 參照T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒方法，將純化的PCR產(chǎn)物與pUCm-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

124 菌落PCR檢測(cè) 利用pUCm-T載體的引物，根據(jù)單菌落PCR檢測(cè)法[11]對(duì)從含有Amp的LB平板上挑取的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)是否為陽(yáng)性克隆。反應(yīng)體系（25 μl）參照Taq PCR Master Mix使用說(shuō)明。反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

125 序列分析 每個(gè)樣品每對(duì)引物隨機(jī)挑選20個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。在GenBank中進(jìn)行Blast序列比對(duì)，從基因數(shù)據(jù)庫(kù)中下載病原菌屬中代表種的16S rDNA或18S rDNA序列，利用MEGA 505等軟件對(duì)所得序列及其它常見(jiàn)食用菌病原微生物模式種的序列進(jìn)行初步的親緣關(guān)系分析，構(gòu)建病原菌屬的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（N-J樹(shù)）。

2 結(jié)果與分析

21 宏基因組DNA的提取

由圖2可知，所得病害樣品的宏基因組DNA片段比較完整，條帶清晰，雜質(zhì)含量較少，表明提取效果好，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

22 單菌落PCR驗(yàn)證

利用載體引物TF與TR對(duì)隨機(jī)挑取的單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，10%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果表明，均能夠擴(kuò)增出與預(yù)計(jì)大?。?6S rDNA約為510 bp，18S rDNA約為420 bp）相符的單一核苷酸片段（圖3、圖4）。

23 序列分析

樣品1平菇黃腐病的測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)表明，20條真菌序列均與平菇Pleurotus ostreatus相關(guān)；細(xì)菌序列中熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens相關(guān)序列15條，鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp相關(guān)序列5條。比對(duì)結(jié)果用MEGA 505軟件分析，從構(gòu)建的N-J樹(shù)（圖5）可以看出，seq PG001與熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）的同源性較高，確定該菌群屬于熒光假單胞桿菌。有報(bào)道稱熒光假單胞桿菌可引起平菇的黃腐病[12]，鞘氨醇桿菌大量存在于環(huán)境中，目前還未有鞘氨醇桿菌能夠引起平菇等食用菌病害的報(bào)道。

樣品2雙孢菇褐斑病的序列比對(duì)結(jié)果表明，細(xì)菌序列中假單胞桿菌Pseudomonas sp相關(guān)序列12條，鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp相關(guān)序列5條，土地桿菌Pedobacter sp相關(guān)序列3條。將對(duì)比結(jié)果構(gòu)建N-J樹(shù)（圖6），結(jié)果表明，seqSBG001與假單胞桿菌（Pseudomonas sp）的同源性較高，seqSBG002與鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp）的同源性較高，seqSBG003與土地桿菌（Pedobacter sp）的同源性較高。宋金俤發(fā)現(xiàn)雙孢菇褐斑病的病原菌為假單胞桿菌[13]，土地桿菌普遍存在于土壤中，可由栽培覆土帶入，目前還未有鞘氨醇桿菌或土地桿菌引起雙孢菇等食用菌病害的報(bào)道。

樣品3雞腿菇黑頭病的序列比對(duì)結(jié)果表明，所測(cè)得的細(xì)菌序列均與假單胞桿菌Pseudomonas sp相關(guān)；真菌序列中與輪枝菌Lecanicillium sp和雞腿菇Coprinus comatus相關(guān)的序列各有10條。構(gòu)建N-J樹(shù)（圖7）進(jìn)行分析，seqJTG001與輪枝菌（Lecanicillium sp）的同源性較高，同時(shí)由于假單胞桿菌可引起食用菌子實(shí)體腐爛，表面發(fā)粘并且有臭味，而雞腿菇黑頭病的腐爛屬于干腐型，表面呈灰狀，無(wú)味，因此，可以初步判斷雞腿菇黑頭病的病原菌為輪枝菌（Lecanicillium sp）。

樣品4金針菇疑似胡桃肉狀菌病的序列比對(duì)結(jié)果表明，20條真菌序列中與Pezizomycetes sp相關(guān)的序列有15條，與金針菇Flammulina velutipes相關(guān)的序列有5條；細(xì)菌序列中與鞘氨醇桿菌Sphingobacterium sp有關(guān)的序列16條，其它不可培養(yǎng)的細(xì)菌的序列4條。由圖8的N-J樹(shù)分析得出，seqJZG001與Pezizomycetes sp的同源性較高，seqJZG002與金針菇（Flammulina velutipes）的同源性較高，seqJZG003為不可培養(yǎng)的細(xì)菌（Uncultured bacterium），seqJZG004與鞘氨醇桿菌（Sphingobacterium sp）的同源性較高。Pezizomycetes sp 屬子囊菌門(mén)（Ascomycota），盤(pán)菌亞門(mén)（Pezizomycotina），盤(pán)菌綱（Pezizomycetes）。由于病害發(fā)生于金針菇發(fā)菌期，初期為白色，后逐漸變?yōu)楹稚?，菌絲表面發(fā)干，而細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生粘液，因此，初步推測(cè)病原菌為Pezizomycetes sp。據(jù)黃年來(lái)等[14]報(bào)道，引起胡桃肉狀菌病的病原菌為胡桃肉狀菌（Diehliomyces microsporus），本研究未能分離出相關(guān)序列。

3 討論

熒光假單胞桿菌（Pseudomonas fluorescens）和假單胞桿菌（Pseudomonas sp）主要寄生在食用菌的子實(shí)體上，起初為小的黃色、褐色斑點(diǎn)，慢慢地發(fā)展成大塊，整個(gè)菇體都變成黃褐色，最終使食用菌子實(shí)體腐爛。金針菇、滑菇、杏鮑菇、平菇及雙孢菇等腐爛病主要是由熒光假單胞桿菌和假單胞桿菌引起的[12～15]，如平菇黃斑病、雙孢菇干腐病的病原都是假單胞桿菌。雞腿菇的黑頭病是一種真菌性的病害，發(fā)病率較高，嚴(yán)重影響了雞腿菇的生產(chǎn)。金針菇病害也多是真菌性的病害，主要發(fā)生在金針菇發(fā)菌期，抑制金針菇菌絲生長(zhǎng)，使其無(wú)法出菇，最終導(dǎo)致減產(chǎn)甚至絕收。關(guān)于本試驗(yàn)得出的輪枝菌（Lecanicillium sp）和Pezizomycetes sp為病原菌的研究仍少有報(bào)道。

能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)食用菌病原菌是控制病害、防止病害快速蔓延的有效方法。相對(duì)傳統(tǒng)微生物分離等方法，宏基因組等分子生物學(xué)技術(shù)為病原菌的快速檢測(cè)開(kāi)辟了新的途徑。利用PCR技術(shù)對(duì)病原菌進(jìn)行檢測(cè)與診斷有著較高的特異性和靈敏度的要求，引物設(shè)計(jì)對(duì)PCR是至關(guān)重要的[16～18]。夏明星等利用熒光PCR技術(shù)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出引起番茄細(xì)菌性潰瘍病的密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種[19]；張祥林等利用細(xì)菌16S rDNA研究西瓜細(xì)菌性果斑病，設(shè)計(jì)了能夠檢測(cè)病原菌的特異性引物[20]；宏基因組的研究也已應(yīng)用于甘蔗、小麥、棉花、柑桔等病害的研究[21～24]。因此，建立基于免培養(yǎng)技術(shù)、快速高效的食用菌病害檢測(cè)方法，為進(jìn)一步的食用菌病害的防治研究奠定了基礎(chǔ)。參 考 文 獻(xiàn)：

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