初 翔，王彥文

(山東農(nóng)業(yè)大學林學院，山東泰安 271018)

1 DEG/ENaC家族簡介

外部環(huán)境存在各種各樣的機械刺激，感知這些刺激的細胞能夠傳導這些信號，到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)。從聽覺、接觸等每一種形式都可以得知我們與周圍事物的相對關系。每一種組織感受這些刺激的細胞是不同的，這些細胞結(jié)構(gòu)上不完全相同，但是這些機械感受器都有共同的分子結(jié)構(gòu)和基礎［1］。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，人們對感受機械刺激的分子機理的認識越來越深入。DEG/ENaC(Degenerin/epithelial sodium channel)家族參與感受機械刺激，研究其如何調(diào)節(jié)感受刺激的分子機理具有重要意義。

DEG/ENaC超家族是在多種生物中具有高度功能多樣化的家族。DEG是Degenerin(變性蛋白)的縮寫，來源于DEG-1和其他相關基因突變所誘導的細胞缺陷。ENaC是Epithelial sodium channel(上皮鈉通道)的縮寫，這種鈉離子通道對阿米洛利(Amiloride或Amipromizide)敏感。DEG最早是在線蟲mec-4和mec-10基因突變體發(fā)現(xiàn)的。實驗發(fā)現(xiàn)，正常線蟲對觸角刺激極其敏感，而當這兩個基因突變時線蟲觸角刺激反應消失。同時，當檢查這兩個基因過表達突變體(Gain of function mutation)時，發(fā)現(xiàn)可引起線蟲觸覺細胞變性，所以因此而得名［2］。mec-4和mec-10基因蛋白與表達在腎、大腸和肺的ENaC同樣對排鈉留鉀利尿藥阿米洛利敏感，因此將具有DEG和ENaC兩者基因編碼特點的蛋白分子統(tǒng)一命名為DEG/ENaC超家族。

動物本體對普通的觸摸和相關的機械刺激感覺是普遍存在的。觸覺感受器的感覺終端在全身都有分布，或者鑲嵌在其他組織當中。最近的研究表明，DEG/ENaC家族與機械刺激有關，同時也可以作為神經(jīng)遞質(zhì)受體存在，對感覺咸味，pH變化等都起到重要作用［3］。在果蠅和線蟲發(fā)現(xiàn)，Rippedpocket(RPK)和Pickpocket(PPK)等基因是DEG/ENaC家族的成員，都與感受機械刺激有關。

2 DEG/ENaC基因家族的結(jié)構(gòu)特點

現(xiàn)已經(jīng)鑒定出DEG/ENaC的家族成員:線蟲有21個，果蠅有30個，蝸牛有1個，哺乳動物至少9個，可分成5個主要的亞家族。DEG/ENaC亞基可以有500-1000個氨基酸長度的變化，包括兩個共同的跨膜區(qū)域TM1和TM2(如圖1)［4］。

圖1 DEG/ENaC超家族蛋白分子結(jié)構(gòu)拓撲圖Fig.1 Anatomy of a DEG/ENaC subunit

位于細胞膜上通道單元含有一個短的N末端和C末端的疏水跨膜區(qū)和一個大的細胞外環(huán)，這個環(huán)包括多個糖基化位點和具有保守跨度的半胱氨酸殘基。這些結(jié)構(gòu)域參與通道活性的控制和孔的形成。這些通道介導活性鈉再吸收的第一步，這對于維持機體鹽和水的自穩(wěn)態(tài)是很必要的。在脊椎動物中，通道控制著在腎臟、結(jié)腸、肺和甜味腺中鈉的再吸收，它們也在味覺認知方面起作用。TM2是離子通道的核心部分，雖然長度很短，但是高度保守，他可以與TM1區(qū)域相連，進而影響通道的開放、離子的吸收、鈉離子的選擇性吸收和運輸。外部的結(jié)構(gòu)域有富含半胱氨酸的保守區(qū)域，對離子通道的基本功能至關重要［4］。

DEG/ENaC家族可被各種刺激所調(diào)控，包括質(zhì)子(ASIC酸敏感型通道)，神經(jīng)肽類(蝸牛的FaNaC)，還有一些機械力等等［4］。同時，DEG/ENaC通道家族成員之間功能上是不均一的，這為闡明基本通道功能的分子基礎提供了獨特的機會，比如配體活性、動力傳導、離子選擇性或者藥物配體的阻斷等。

3 DEG/ENaC基因家族組成

3.1 DEGs亞家族

DEGs亞家族主要是在線蟲中發(fā)現(xiàn)的，在脊椎動物和哺乳動物尚未發(fā)現(xiàn)。分析mec的突變體(mec-4和mec-10可以編碼DEG/ENaC通道家族)，正常線蟲可以對觸角刺激極其敏感，而當這兩個基因突變時線蟲對觸覺刺激反應消失。隨后發(fā)現(xiàn)了MEC-4、MEC-10、UNC-8、UNC-105和DEG-1等5個成員，這些通道在受機械刺激時開放，因而在線蟲的觸覺和機械感受中發(fā)揮作用［5］。

3.2 ASICs亞家族

酸敏感離子通道(ASICs)是一類陽離子通道，表達在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)?？梢员患毎馑峄h(huán)境或物質(zhì)所激活，屬于鈉通道超家族的成員，對K+和Ca2+具有較低的通透性。近來發(fā)現(xiàn)，ASICs不但在神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生物學功能，而且在味蕾、心血管、骨骼等的生理和病理過程中具有重要作用。到目前為止，已克隆了由4個基因編碼的7個ASICs亞基，它們分別是 ASIC1a、1b、1b2、2a、2b、3 和 4［6］。ASIC1a、ASIC2a、ASIC2b 在腦內(nèi)主要表達于海馬小腦、大腦皮質(zhì)、嗅球、松果體韁、基底外杏仁核等。在外周ASICs主要存在于與疼痛感覺有關的小直徑神經(jīng)元，在DRG、觸壓覺神經(jīng)末梢及其周圍組織、心臟交感神經(jīng)傳入末梢均有表達［7］。這些亞基在表達系統(tǒng)中可形成功能性同聚體通道 ASIC1a、ASIC1b、A2SIC2a和ASIC3;無功能同聚體通道ASIC2b和ASIC4及多種異聚體通道。這7個亞基所組成的同聚體或異聚體酸敏感離子通道表現(xiàn)出不同的電流表型、通道特性和離子選擇性。作為受體接受H+刺激的部位是在胞外，是保持通道基本功能的位點，與通道門控相關的部位是胞外接近TM2的甘氨酸(Gly)430處;而直接影響通道開放的概率、Na+選擇性和離子通透性的位點則為胞內(nèi)接近TM1處的9個保守的氨基酸序列。對ASIC的研究發(fā)現(xiàn)，ASICs在特定的表皮機械感受神經(jīng)末梢有表達，說明ASICs可能是機械刺激感受的位點之一。Price等發(fā)現(xiàn)ASIC2基因敲除，小鼠的皮膚對輕觸覺的敏感性明顯降低，但并未使H+激活的電流在感覺神經(jīng)元中消失，表明ASIC2可能存在與其他ASICs異聚體對觸覺的協(xié)同作用［8］。隨后發(fā)現(xiàn)ASIC3基因沉默小鼠對輕觸覺的反應性是增強的。ASIC2和ASIC3是正常觸覺產(chǎn)生所必須的組分，并可能以異聚體形式組成觸覺感受復合體的中心成分［9］。

3.3 ENaCs亞家族

ENaC是由α、β、γ 3個高度同源亞單位組成的非電壓依賴性通道，對阿米洛利敏感［10］，其中α亞基對通道功能起主導作用［11］。ENaC負責腎臟Na+的限速重吸收，對于維持細胞外液量、血壓、鈉的自身平衡起重要作用，ENaC基因被認為是EH的重要候選基因。最近證實的βENaC和γENaC廣泛存在于哺乳動物頸、腰髓、與有髓纖維聯(lián)系的NF200陽性細胞和外周足底皮膚內(nèi)分布于Merkel觸盤、Meissner小體和Pacini小體的粗有髓神經(jīng)纖維和終末端中，說明這兩個成員可能屬于皮膚機械感受器［12］。

3.4 BNCs/BNaCs亞家族

BNCs亞家族包括BNC1和BNC2兩個成員，都只在腦組織中表達。人、大鼠和小鼠的BNC1基因，分別命名為BNC1、MDEG和BNaC1，含有由1539個堿基構(gòu)成的開放閱讀框，全長1809個堿基，編碼由512個氨基酸構(gòu)成的蛋白質(zhì)。多標記染色顯示，BNC1在L 4-L 5節(jié)段表達于21%的DR神經(jīng)元，有90%以上NF200陽性細胞都與其共存，而只有少于4%的外周蛋白陽性小細胞含有BNC1;在外周足底皮膚，BNC1廣泛存在于支配毛囊、Merkel觸盤、Meissner小體和 Pacini小體的粗有髓神經(jīng)纖維和終末。在正常狀況下，DRG中BNC1蛋白只向外周單方向轉(zhuǎn)運而不向脊髓中樞轉(zhuǎn)運，脊髓后索和灰質(zhì)也無BNC1的表達［13］。與野生小鼠比較，BNC1基因沉默小鼠的DRG中BNC1的mRNA和編碼的蛋白消失，支配皮膚毛囊的梳狀BNC1免疫反應陽性纖維消失，離體單纖維記錄發(fā)現(xiàn)外周皮膚快適應機械感受器和慢適應機械感受器對機械刺激反應顯著減弱，而A D和C傷害性感受器以及A D絨毛D機械感受器的反應正常，進一步證實BNC1可能是哺乳動物軀體機械感受器［14］。

3.5 FaNaC亞家族

在無脊椎動物的神經(jīng)系統(tǒng)有很多FMRFamide以及與其相關的肽類物質(zhì)，它們是作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用［15，16］。FMRFamide還沒有在哺乳動物中分離出來，但在哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)是確實存在的。FMRFamide通常調(diào)節(jié)兩種離子通道功能:FMRFamide的門控性Na+通道(FaNaC)和哺乳動物酸敏感離子通道(ASIC)。FMRFamide是通過G蛋白偶聯(lián)受體，激活Na+的傳導發(fā)揮作用的。

現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MRFamide直接調(diào)控Na+通道，沒有涉及G蛋白的參與［17］。FaNaC是目前唯一已知由肽類物質(zhì)調(diào)控的離子通道，是由653個氨基酸組成。屬于ENaC/DEG家族成員，具有兩個跨膜的結(jié)構(gòu)域，和一個較大的胞外域。近來發(fā)現(xiàn)三種FaNaC通道:蝸牛HtFaNaC，椎實螺 LsFaNaC，黑斑海兔AkFaNaC。當FMRFamide刺激時，在爪蟾卵母細胞和哺乳動物細胞這三種FaNaC通道都能夠產(chǎn)生內(nèi)向電流［18-22］。

雖然LsFaNaC在體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)表達，但是仍可以推測它也具有相似的特征。HtFaNaC同HaFaNaC有65%相似，LsFa-NaC同HaFaNaC有60%相似。由于HaFaNaC和HtFaNaC對FMRFamide和amiloride的敏感度不同，推測FMRFamide的識別區(qū)域可能位于胞外環(huán)90個氨基酸區(qū)域［23］。另外，F(xiàn)aNaC的離子通道包括含有一個較大的親水孔道，可以選擇性調(diào)控外部物質(zhì)的進出。

在每種生物的中央神經(jīng)節(jié)，存在大量FMRFamide門控Na+通道，含有大量FaNaC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。原位雜交發(fā)現(xiàn)，在椎實螺超過400個神經(jīng)元表達FaNaC基因，包括RpeD1神經(jīng)元［24］。通過逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，HaFaNaC和LsFaNaC在神經(jīng)系統(tǒng)和腿部肌肉也有一定程度的表達。FaNaC在各種功能的神經(jīng)元中大量存在，但是只有一小部分神經(jīng)元能夠表達翻譯產(chǎn)物蛋白。

DEG/ENaC家族成員的關系見圖2。

4 PPK基因的功能

PPK基因是DEG/ENaC家族的成員，種類很多，對各種不同的機械刺激司職不同的功能，共同感受外界環(huán)境的變化?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn) PPK1、rpk、PPK4、PPK6、PPK7、PPK10、PPK11、PPK12、PPK13、PPK14、PPK16、PPK19、PPK20、PPK21、PPK23、PPK2816種DEG/ENaC家族的編碼基因。下面列舉了國內(nèi)外發(fā)現(xiàn)的PPK基因的功能。

4.1 PPK1參與身體規(guī)律性運動

中樞系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)共同調(diào)節(jié)身體的規(guī)律性運動。PPK1基因位于果蠅2號染色體的左臂，位置是35B1。PPK1基因是果蠅DEG/ENaC家族成員之一，在MD感覺神經(jīng)元、幼蟲的身體表面和腦部的兩極神經(jīng)元都有表達。PPK1基因突變體幼蟲有正常的體外接觸，但是在爬行行為上有影響。抑制PPK1基因功能時，引起爬行速度加快和運動方式無規(guī)律，運動的時間會大幅度增長。轉(zhuǎn)基因PPK1時，運動行為得到恢復。這些結(jié)果表明，PPK1基因?qū)刂埔?guī)律性運動及保持身體的運動功能完整有重要作用［25］。

圖2 DEG/ENaC家族成員的關系樹Fig.2 Phylogenetic tree of DEG/ENaC ion channel family

4.2 PPK4和PPK10參與氣管液體基質(zhì)清除

生物體需要氧氣來滿足自身組織的新陳代謝和生長發(fā)育。在哺乳動物中，肺部的網(wǎng)絡分支狀結(jié)構(gòu)，幫助氧氣溶解于血液中，運輸?shù)礁鹘M織器官中。果蠅和哺乳動物在氣管的結(jié)構(gòu)上相似。在生長發(fā)育時，最初氣管組織是實質(zhì)的，最后這個系統(tǒng)必須清除液體基質(zhì)，充滿空氣。在果蠅中，發(fā)現(xiàn)PPK4，-10，-11，-12，和 -13主要負責這項功能。在哺乳動物這種變化是在出生時發(fā)生的，上皮細胞能夠吸收器官的液體基質(zhì)。在果蠅中這種變化出現(xiàn)在幼蟲孵化的2h左右。當用UAS-eGFP系統(tǒng)驅(qū)動表達，PPK4，-10，-11，-12，和 -13在幼蟲的氣管系統(tǒng)中表達。雖然PPK4和 PPK10都在成蟲氣管系統(tǒng)中表達，但它們具有不同的表達方式，PPK4在背側(cè)的主干中表達，PPK10也在背側(cè)主干上皮細胞中表達，但是在氣孔周圍表達很明顯。用RNAi技術使PPK4和PPK11沉默時，發(fā)現(xiàn)果蠅的氣管無法正常排除液體基質(zhì)，影響正常的呼吸功能。當然清除液體基質(zhì)這種轉(zhuǎn)變的發(fā)生也需要其他PPK基因的共同參與才能完成的［26］。

4.3 PPK11和PPK19參與味覺感受

所有的陸生動物都有檢測環(huán)境中鹽度的能力，味覺系統(tǒng)是主要的化學感覺系統(tǒng)，能夠

感覺NaCl和其他鹽類。這種感覺系統(tǒng)可以使動物檢測、攝食、辨別不同濃度的鹽類，避免高濃度鹽富集。DEG/ENaC成員PPK11和PPK19是與感覺鹽類有關的基因，在幼蟲的味覺末端組織中、成蟲的腿部和翅膀的邊緣表達，參與味覺的感受。當用RNAi沉默PPK11和PPK19時，幼蟲失去辨別能力，無法把低濃度的Na+或者K+與水分辨開。對低濃度的鹽類電生理反應是不敏感的，而幼蟲對蔗糖和對氣味的反應都是正常的。說明PPK11和PPK19對檢測Na+和 K+等鹽類具有重要作用［27］。

5 展望

DEG/ENaC基因家族的功能是參與感受機械刺激，而PPK基因是DEG/ENaC家族的成員，對各種不同的機械刺激發(fā)揮不同的作用，共同感受外界環(huán)境的變化。隨著電生理學和基因工程技術的發(fā)展，未來工作的重心將轉(zhuǎn)移到PPK基因的具體功能上，通過轉(zhuǎn)基因技術等研究它們的生理作用。目前對PPK基因的研究是不完整的，例如基因如何參與通道打開，信號傳導等，一些PPK基因的作用也不是很清晰。PPK基因正成為一個有潛力的熱門研究對象而被更多學者關注，因此PPK基因的功能將是未來研究的重要方向。

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