蔣鳳琴，袁玉梅，汪榮華，姚 沖，曹恒斌

原發(fā)性肝癌是嚴重危害人類健康的疾病之一，目前對原發(fā)性肝癌的治療仍以手術(shù)切除為首選方法。對無法手術(shù)的患者，化療單獨使用效果不理想，目前多采用肝動脈栓塞化療(TACE)。TACE可增加病灶局部濃度，提高療效，還能減輕全身毒性反應(yīng)。常用的藥物有順鉑(DDP)、吉西他濱等。丙戊酸(VPA)作為一線抗癲疒間藥物，已長期應(yīng)用于臨床，其藥理毒理已比較明確。在臨床用藥劑量范圍內(nèi)，能夠有效抑制去乙酰化酶(HDACs)活性，通過誘導(dǎo)細胞凋亡和分化、促使細胞周期阻滯而抑制多種腫瘤細胞增殖。多項研究均證實了VPA對肝癌細胞具有抑制作用［1-4］。本研究通過使用不同濃度的VPA聯(lián)合順鉑對人肝癌細胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721的抑制作用，離體評價VPA聯(lián)合順鉑對人肝癌細胞的療效，探索其對肝癌在聯(lián)合化療過程中的增效作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀(Dynex，日本);顯微鏡(Leica，德國);細胞培養(yǎng)箱(Thermo，美國);恒溫培養(yǎng)箱(上海實驗儀器廠);水浴箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司);凈化操作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司);離心機(上海手術(shù)器械廠)。

1.2 材料 VPA(購自Sigma公司);順鉑(購自齊魯制藥有限公司，0100241DB);MTT(購自Amresco公司);DMSO(購自Amresco公司);DMEM(購自GIBCO公司);胎牛血清(購自GIBCO公司);青霉素/鏈霉素雙抗(購自GIBCO公司);胰蛋白酶(購自GIBCO公司);人肝癌細胞系HepG2細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫);人肝癌細胞系BEC7404細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫);人肝癌細胞系SMMC7721細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫)。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 取人肝癌細胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721細胞，應(yīng)用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。每2 d換1次培養(yǎng)液。細胞生長至對數(shù)期用0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)，臺盼藍染色證實活細胞≥95%并計數(shù)細胞，備用。

2.2 細胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期人肝癌細胞系 HepG2、BEC7404、SMMC7721細胞，以5 ×104/孔接種于6孔板。37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)24 h后，分別加入終濃度為300 μg/mL 的VPA、18 μg/mL 的 DDP，DDP+VPA 組為 18 μg/mL+300 μg/mL。處理24、48、72 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

2.3 細胞增殖檢測 用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期人肝癌細胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721，細胞計數(shù)調(diào)整為5×104/mL，每孔100 μL接種于96孔板，37℃、5%CO2過夜貼壁培養(yǎng)24 h后，分別加入3種不同濃度的VPA溶液10 μL，使細胞培養(yǎng)液濃度梯度為 300 μg/mL、100 μg/mL、33 μg/mL，加入3種不同濃度的DDP溶液10 μL，使細胞培養(yǎng)液濃度梯度為 18 μg/mL、6 μg/mL、2 μg/mL，得VPA聯(lián)合DDP共9組(見表1)，并設(shè)不加藥物的細胞作為對照組。

表1 VPA+DDP的9組濃度梯度(μg/mL)

用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加入 MTT 液(5 mg/mL)10 μL，37℃避光培養(yǎng)4 h，棄細胞培養(yǎng)液后，每孔加入DMSO 100 μL，溶解紫藍色結(jié)晶，輕輕振蕩 10 min，使結(jié)晶物充分溶解。將96孔板置全自動酶標儀上，用酶標儀測定吸光度(OD)值，測定每孔490 nm波長OD值，實驗重復(fù)2次，每一次、每一濃度及每時段均設(shè)3復(fù)孔。計算不同作用時間各組物質(zhì)對A549細胞及HepG2細胞的抑制率。按下式計算藥物對細胞增殖的抑制率(IR):IR=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100%。聯(lián)合用藥對細胞增殖抑制率的計算用q表示，q=R(A+B)［RA+(1-RA)/RB］。R(A+B)為兩藥聯(lián)合使用時對細胞的抑制率，RA為A藥對細胞的抑制率，RB為B藥對細胞的抑制率。若q值在0.85～1.15范圍內(nèi)，表示兩藥作用相加;q值＞1.15表明兩藥作用協(xié)同;q值＜0.85表示兩藥合用有拮抗作用。

3 結(jié)果

3.1 細胞形態(tài)的影響 單獨使用VPA或使用DDP處理人肝癌細胞系 HepG2、BEC7404、SMMC7721細胞，在24 h后其細胞數(shù)目開始減少，但細胞形態(tài)未見明顯變化;VPA聯(lián)合DDP處理，其細胞數(shù)目減少略為明顯，細胞形態(tài)略有變化。但隨著處理時間延長，VPA組、DDP組、VPA+DDP組的細胞數(shù)目均減少，細胞形態(tài)發(fā)生改變。至72 h后，VPA組、DDP組、VPA+DDP組細胞數(shù)目減少十分明顯，其中，VPA+DDP組較單獨用藥組減少更為顯著，其細胞形態(tài)大小不等，多成球形，高倍鏡檢可見核固縮加劇、胞漿減少，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，細胞脫壁呈半懸浮狀態(tài)，培養(yǎng)基中有較多的細胞碎片及死細胞。見圖1(處理72 h)。結(jié)果表明，在對肝癌細胞系HepG2、BEC7404、SMMC7721的增殖抑制上，VPA聯(lián)合DDP組具有更為顯著的抑制效果，且隨著作用時間的延長，其抑制作用有增強的趨勢。

3.2 VPA聯(lián)合DDP對人肝癌細胞的增殖抑制作用 使用三組不同濃度的VPA、DDP、VPA+DDP處理對數(shù)生長期的 HepG2、BEC7404、SMMC7721細胞24、48、72 h后，MTT比色法顯示，對照組細胞生長率明顯高于各實驗組，各實驗組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，聯(lián)合用藥組對細胞增殖的抑制率(IR)更為顯著，且隨著藥物濃度增加及作用時間延長，各組對細胞增殖IR明顯增加。見表2～表7。表明VPA聯(lián)合DDP對人肝癌細胞生長有更強的抑制作用，且這種抑制作用的強度與藥物濃度、作用時間有關(guān)。

3.3 聯(lián)合用藥對人細胞增殖抑制率的影響 通過計算各組藥物對細胞增殖的抑制率(IR)，進一步計算VPA聯(lián)合DDP對人肝癌細胞增殖IR的增強是否具有協(xié)同作用。使用q值來表示兩藥聯(lián)用的協(xié)同作用。結(jié)果表明，VPA為300 μg/mL及100 μg/mL時，兩藥物聯(lián)合使用有明確的協(xié)同作用;當VPA為33 μg/mL時，其協(xié)同作用不夠明確。DDP的濃度及作用時間對兩藥物的協(xié)同作用無明顯影響。見表8。

圖1 VPA、DDP、VPA+DDP 對 HepG2、BEC7404、SMMC7721 的增殖抑制

表2 VPA、DDP對HepG2細胞增殖的影響

表3 VPA+DDP對HepG2細胞增殖的影響

表4 VPA、DDP對BEC7404細胞增殖的影響

表5 VPA+DDP對BEC7404細胞增殖的影響

表6 VPA、DDP對SMMC7721細胞增殖的影響

表7 VPA+DDP對SMMC7721細胞增殖的影響

表8 聯(lián)合用藥對HepG2細胞增殖抑制率的q值

4 討論

當前國際上將去乙?；敢种苿?HDACI)作為治療腫瘤的一個新的前沿，VPA作為Ⅰ和Ⅱ型HDACI，可以有效促使多種腫瘤細胞的形態(tài)和代謝改變，抑制細胞生長、分化及凋亡用［5-6］。Takai等［7］發(fā)現(xiàn)，VPA能有效抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的生長，細胞周期分析顯示，HDACIs可以減少S期細胞的比例，增加G0-G1與/或G2-M的細胞比例。侯華英等［8］探討VPA對人宮頸癌細胞HeLa的增殖機制，結(jié)果表明，VPA通過增加Caspase3蛋白表達，下調(diào)bcl-2蛋白的表達，誘導(dǎo)HeLa細胞凋亡、抑制細胞增殖。羅恒等［9］發(fā)現(xiàn)，VPA可抑制肺癌A549細胞生長，改變細胞周期分布，促進細胞凋亡。

在治療肝癌方面，Armeanu等［1］發(fā)現(xiàn)，VPA 對肝癌細胞具有抗增殖與凋亡作用，且對肝細胞沒有影響。時昌文等［2-4］證實了丙戊酸鈉對肝癌細胞系HepG2的生長抑制作用與濃度呈劑量依賴趨勢，上調(diào)Caspase3、Caspase9的蛋白表達及活性可能是VPA誘導(dǎo)細胞凋亡的主要途徑。此外，VPA通過逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞組蛋白低乙?；揎椝絹硪种聘伟┘毎忠u轉(zhuǎn)移，下調(diào)MMP-2與MMP-9蛋白表達可能是其發(fā)揮作用的主要機制之一。

VPA作為HDACI，可以增強多種化療藥物的療效。Trus等［10］發(fā)現(xiàn)，VPA聯(lián)合全反式維甲酸(ATRA)在治療急性骨髓系白血病(AML)中，可以增強腫瘤細胞的敏感性。兩組不同臨床試驗分別顯示出VPA聯(lián)合ATRA對部分患者具有緩解作用［11-12］。Catalano等［13］研究發(fā)現(xiàn)，VPA 在治療癲疒間的濃度范圍，可以增強阿霉素對未分化甲狀腺癌細胞的作用。VPA可以促使微管蛋白乙?；?，增強紫杉醇(Taxol)在甲狀腺癌細胞株中的凋亡活性［14］。Hubaux 等［15］證實，在小細胞肺癌(SCLC)的臨床前治療上，VPA聯(lián)合標準一線化療方案(DDP聯(lián)合依托泊苷)，可以有效提高化療藥物的療效。李益清等［16］報道，丙戊酸聯(lián)合阿糖胞苷(Ara-C)對白血病細胞株 HL-60及耐藥細胞株HL-60/HT具有協(xié)同療效，VPA還能抑制HL-60/HT，降低耐藥細胞株對Ara-C的耐藥性。

VPA在治療癲疒間時的血漿濃度一般≤100 μg/mL，高于此濃度可能會發(fā)生較嚴重的不良反應(yīng)。本研究將100 μg/mL作為基值，選擇3組濃度梯度，考察了VPA聯(lián)合化療藥物DDP對人肝癌細胞的抑制作用。結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組的抑制率較單藥組顯著增強，并且與藥物濃度、作用時間呈依賴趨勢，在VPA較高濃度(≥100 μg/mL)時，聯(lián)合組具有明顯的協(xié)同優(yōu)勢。

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