王林林，蔡 強(qiáng)，何 寧，姚恩泰，陳汝賢，許鴻章，解云英

新型尿苷肽類化合物Sansanmycin P的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究

王林林，蔡 強(qiáng)，何 寧，姚恩泰，陳汝賢，許鴻章，解云英

目的 從放線菌 Streptomyces sp SS 發(fā)酵液中分離新型活性尿苷肽類似物。

抗生素類，抗結(jié)核； 假單胞菌，銅綠；Sansanmycin P

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(4):264-268

尿苷肽類抗生素是一類具有相同母核結(jié)構(gòu)的化合物，主要包括 Sansanmycin、Mureidomycin、Pacidamycin 和 Napsamycin[1]。這類抗生素通過抑制 UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽轉(zhuǎn)位酶（MraY 轉(zhuǎn)位酶）而抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成。這種獨(dú)特的機(jī)制使其與現(xiàn)有抗菌藥物不會(huì)產(chǎn)生交叉耐藥，從而成為尋找新型的低毒、窄譜抗菌藥物的候選化合物或先導(dǎo)化合物[2-6]。本課題組在前期的抗菌藥物篩選研究中，從放線菌 Streptomyces sp SS 的發(fā)酵液中分離到了一組具有抗銅綠假單胞菌和結(jié)核桿菌活性的尿苷肽類化合物 Sansanmycins[7-11]，對其進(jìn)一步研究，又分離到了一個(gè)新型的尿苷肽類化合物Sansanmycin P。本文對 Sansanmycin P 的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定和抗菌活性進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 放線菌 Streptomyces sp SS 從中國貴州土壤中分離得到；銅綠假單胞菌由本所菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基為 ISP2 培養(yǎng)基；種子和發(fā)酵培養(yǎng)基由葡萄糖 3%、淀粉 0.5%、蛋白胨0.6%、(NH4)2SO40.7%、CaCO30.2% 組成；檢定培養(yǎng)基為MH 培養(yǎng)基。

1.1.3 儀器及試劑 HPLC-1200 購自美國安捷倫公司；質(zhì)譜數(shù)據(jù)用美國賽默飛世爾公司的 LTQ XT ion trap 型質(zhì)譜儀采集；核磁數(shù)據(jù)用 Varian VNS-600采集；分析色譜柱 XBridge C18柱（4.6 mm × 150 mm，3.5 μm）及制備色譜柱 XBridge C18 OBD Prep 柱（19 mm × 150 mm，5 μm）均購自美國Waters 公司；大孔吸附樹脂 D4006 和 X5 購自南開大學(xué)精細(xì)化工廠；離子交換樹脂 DEAE-葡聚糖凝膠 A-25 購自上?；瘜W(xué)試劑廠。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng) 菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28 ℃ 培養(yǎng) 7 d 后接種于種子培養(yǎng)基中，于 28 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng) 2 d，將生長良好的種子按10% 的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min發(fā)酵培養(yǎng) 5 d。

1.2.2 提取、分離和純化 發(fā)酵液合并、離心，棄菌絲體，上清液上 D4006 大孔樹脂柱，依次用水、10%、20%、30%、50% 丙酮各 12 L 洗脫，檢測各組分抗銅綠假單胞菌活性，合并活性部分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥，得粗品。將粗品溶于 10 ml 0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.5）溶液中，上DEAE-葡聚糖凝膠柱 A-25，用 0.02 mol/L Tris-HCl加不同濃度的 NaCl 洗脫，分部收集，HPLC 檢測，按組分合并，經(jīng) X5 大孔吸附樹脂柱脫鹽后，冷凍干燥，除得到已經(jīng)報(bào)道的 Sansanmycin 外，還得一潛在的新組分 Sansanmycin P。將其溶于 2 ml 水中，用制備液相進(jìn)行制備，流動(dòng)相為 MeOH∶0.1% (NH4)2CO3= 32∶68，流速：5 ml/min。合并純度大于 90% 的組分，脫鹽后將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥。

1.2.3 抗菌活性 抗結(jié)核桿菌 H37Rv 活性以微孔板法（microplate alamar blue assay，MABA）[12]測定，以利福平和異煙肼為陽性藥，并與 Sansanmycin家族已報(bào)道化合物抗結(jié)核活性對比?？广~綠假單胞菌活性采用微量板液體稀釋法測定。

2 結(jié)果

2.1 Sansanmycin P 的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)鑒定

圖1 Sansanmycin P 母離子（m/z 890）的 ESI-MS/MS 分析結(jié)果Figure1 ESI-MS/MS data of parent ion peak (m/z 890) of Sansanmycin P

圖2 Sansanmycin P 的部分 HMBC 和1H-1H COSY 數(shù)據(jù)Figure2 Selected HMBC and1H-1H COSY data for Sansanmycin P

2.2 抗菌活性

Sansanmycin P 對結(jié)核桿菌 H37Rv 和銅綠假單胞菌的抑制活性均較弱（MIC > 32 μg/ml），低于Sansanmycin A 的抗菌活性（表 2）。

3 討論

2000 年，Bozzoli 等[15]通過固相合成法合成了一系列 Mureidomycin 類似物，證明中心模塊AMBA 為活性必需基團(tuán)。2001 年，Boojamra 等[4-5]全合成了二氫 Pacidamycin 及其衍生物，并闡明了其立體構(gòu)型，表明其中所有氨基酸均為天然的S 構(gòu)型，AMBA 為（2S，3S）構(gòu)型，為活性必需構(gòu)型；3'-脫氧尿苷可能與 MraY 轉(zhuǎn)位酶的底物——UDP 競爭活性部位，也是活性所必需基團(tuán)。Howard和 Bugg[16]對 Mureidomycin A 的氨基作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明：肽鏈的氨基末端對酶的抑制活性是非常重要的，推測 Mureidomycin A 可能是通過末端銨離子與 MraY 轉(zhuǎn)位酶活性中心的 Mg2+結(jié)

合位點(diǎn)結(jié)合而起到抑制作用。我們實(shí)驗(yàn)室前期通過半合成方法也對 N-末端進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究，結(jié)果表明，N 上連接的烷基空間位阻可能影響化合物與 MraY 轉(zhuǎn)位酶間的相互作用[17]。這可能解釋了Sansanmycin P 抗菌活性低的原因，Sansanmycin P的 N 末端四氫異喹啉結(jié)構(gòu)上 1 位甲基的存在影響了銨離子與 MraY 轉(zhuǎn)位酶活性中心的 Mg2+結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，從而影響了化合物的抗菌活性。

表1 Sansanmycin P 的1H-NMR（600 MHz）和13C-NMR（150 MHz）數(shù)據(jù)Table1 1H-NMR (600 MHz) and13C-NMR (150 MHz) data for Sansanmycin P

表2 Sansanmycin P 對銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌 H37Rv 的 MIC 值（μg/ml）Table2 MIC values of Sansanmycin P against Pseudomonas aeruginosa and Mycobacterium tuberculosis H37Rv (μg/ml)

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Isolation, structural determinatio n and biological activity of novel uridyl peptide compound Sansanmycin P

WANG Lin-lin, CAI Qiang, HE Ning, YAO En-tai, CHEN Ru-xian, XU Hong-zhang, XIE Yun-ying

Objective To isolate new uridyl peptide components from the fermentation broth of Streptomyces sp. SS.Methods The new component was isolated and purified by various chromatography methods, such as macroporous adsorption resins, ion exchange resin and reversed-phase HPLC. Its structure was elucidated by spectroscopic analyses, such as UV, MS, MS/MS, 1D and 2D NMR.Results A novel uridyl peptide antibiotic, Sansanmycin P, with an N-terminal containing 1-methyl-6-hydroxy-1,2,3,4-tetrahydro-3-isoquinoline carboxylic acid was obtained. Antibacterial activity in vitro, resistance of Pseudomonas aeruginosa MIC > 32 μg/ml, Mycobacterium tuberculosis MIC > 32 μg/ml.Conclusion Sansanmycin P is a novel Sansanmycin analogue with certain antimicrobial activities against Mycobacterium tuberculosis and Pseudomonas aeruginosa.

Antibiotics, antitubercular; Pseudomonas aeruginosa; Sansanmycin P

XIE Yun-ying, Email: xyying102@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.005

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273415）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2012ZX09301002-001-018）

100050 北京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學(xué)室

解云英，Email：xyying102@163.com

2013-04-28

方法 發(fā)酵液經(jīng) D4006 大孔吸附樹脂、DEAE-葡聚糖凝膠及制備液相分離純化，獲得單一化合物；根據(jù) UV、MS、MS/MS、1D 和 2D NMR 確定化合物結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行抗菌活性研究。

結(jié)果 分離純化得到 1 個(gè) N-末端含有1-甲基-6-羥基四氫異喹啉的尿苷肽類化合物 Sansanmycin P。初步體外抗菌活性，抗銅綠假單胞菌 MIC > 32 μg/ml，抗結(jié)核桿菌 MIC > 32 μg/ml。

結(jié)論 Sansanmycin P 為全新結(jié)構(gòu) Sansanmycins 類似物，具有一定抗結(jié)核桿菌和銅綠假單胞菌活性。

Author Affiliation: Microorganism and Chemistry Laboratory, Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):264-268