潘雪刁，楊周萍，周四桂，楊志英，臧林泉，王桂香

芹菜素對(duì)人肺癌A549細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

潘雪刁，楊周萍，周四桂，楊志英，臧林泉，王桂香

目的 研究芹菜素對(duì)人肺癌 A549 細(xì)胞增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用與 Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響。

芹菜素； 肺腫瘤； 細(xì)胞增殖； 細(xì)胞凋亡； bcl-2 相關(guān) X 蛋白； 原癌基因蛋白質(zhì) c-bcl-2

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2013, 8(4):259-263

肺癌是全球范圍內(nèi)最常見、致死人數(shù)最多的惡性腫瘤之一[1]，也是我國第一大癌癥，其發(fā)病率及死亡率增長最為迅速[2]。目前肺癌的主要治療手段是化療，但化療的毒副作用如骨髓抑制等卻限制了其應(yīng)用。研發(fā)新型活性高、毒副作用小的抗肺癌藥物一直是腫瘤治療領(lǐng)域的重要任務(wù)，近年來中藥抗肺癌研究也取得了很大進(jìn)展。

芹菜素（apiginin，API），又稱芹黃素，是一種天然存在的黃酮類化合物，廣泛分布于溫?zé)釒У氖卟撕退校纫郧鄄酥泻繛楦?，具有廣泛的藥理作用[3]，其對(duì)腫瘤的防治作用及其機(jī)制得到廣泛的關(guān)注和研究[4-11]，但有關(guān)芹菜素抗肺癌作用的實(shí)驗(yàn)研究尚少。本實(shí)驗(yàn)觀察了芹菜素對(duì)人肺癌細(xì)胞株A549 的增殖抑制以及誘導(dǎo)凋亡作用，初步探討其促進(jìn)凋亡的機(jī)制，為肺癌的防治提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物、試劑 芹菜素（質(zhì)量分?jǐn)?shù) ≥ 98 %，批號(hào)：22806）購自上海阿拉丁公司；MTT、Hoechst 33258、DMSO、亮肽酶、抑肽酶、疊氮鈉、二硫蘇糖醇購自美國 Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）均購自美國 Gibco 公司；AnnexinV-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；人抗兔 Bax、Bcl-2 及GAPDH 抗體購自美國 Abcam 公司；羊抗兔二抗購自美國 CST 公司；PVDF 膜購自美國 Millipore公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 EPICS XL 分析型流式細(xì)胞儀為美國 Beckman 公司產(chǎn)品；Zeiss Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡為德國 Carl Zeiss 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng) 人肺癌細(xì)胞株 A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；培養(yǎng)于含 10% 胎牛血清的 DMEM 培養(yǎng)液中，于 37 ℃、5% CO2、95% O2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將 A549細(xì)胞以 1 × 104個(gè)/孔接種于 96 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L芹菜素，每孔 200 μl，每個(gè)濃度設(shè)置 6 個(gè)平行孔，培養(yǎng) 24、48、72 h 后，向每孔中加入 5 g/L 的MTT 20 μl 繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，棄上清，向每孔中加入DMSO 100 μl 溶解結(jié)晶體，置于搖床振蕩 10 min，至藍(lán)紫色顆粒完全溶解后，于酶標(biāo)儀 570 nm 波長處測(cè)定每孔吸光度值（A），并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（%）=（對(duì)照孔 A 值 - 加藥孔 A 值）/對(duì)照孔 A 值 × 100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.3 Hoechst 33258 細(xì)胞核染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)改變 細(xì)胞處理同“1.2.2”項(xiàng)方法，芹菜素作用 24 h 后，吸去培養(yǎng)液，用 PBS 清洗2 次，迅即加入 40 g/L 的多聚甲醛液固定 10 min后，吸去固定液，以 PBS 清洗 1 次，加入 5 mg/L的 Hoechst 33258，染色 10 min，用 PBS 清洗3 次后，自然干燥，在 Zeiss Axio Observer A1 熒光倒置顯微鏡下以 340 nm 激發(fā)光觀察細(xì)胞凋亡形態(tài)并隨機(jī)拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀 AnnexinV-FITC/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將 A549 細(xì)胞以 1 × 105個(gè)/孔接種于 6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后，分別加入終濃度為 0、10、20、40、80 μmol/L 芹菜素，每孔 1 ml，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 后，按照 AnnexinV- FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù) Annexin V-FITC(X)/PI（Y 軸）熒光做對(duì)數(shù)散點(diǎn)圖，可獲得由 4 個(gè)象限組成的雙參數(shù)圖：左上象限（K1）為細(xì)胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細(xì)胞，右上象限（K2）為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，左下象限（K3）為活細(xì)胞，右下象限（K4）為早期凋亡細(xì)胞，每個(gè)象限的細(xì)胞數(shù)即為受檢總細(xì)胞數(shù)中所占的比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè) Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá) 細(xì)胞處理同“1.2.4”項(xiàng)方法，芹菜素作用 24 h后，收集細(xì)胞，在每管細(xì)胞中加入 100 μl 的蛋白裂解液后，取 20 μl 的細(xì)胞裂解液加入 5 μl 上樣緩沖液中，沸水浴 5 min，12 000 × g 離心 3 min，去除不溶性蛋白，考馬斯亮藍(lán) G-250 法進(jìn)行總蛋白定量，每泳道上樣量為 25 μg 總蛋白，經(jīng) 10% SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上。用含 5%脫脂牛奶的 TBST 室溫下封閉 90 min，加入稀釋好的一抗 Bax（1∶5000）、Bcl-2（1∶1000），4 ℃ 孵育過夜。TBST 洗膜后，加 5 ml 1∶5000 稀釋的羊抗兔二抗，室溫孵育 1 h 后，TBST 洗膜，然后加入 ECL 化學(xué)發(fā)光液，X 光片暗室曝光、顯影及定影。采用 WO-9413B 型凝膠成像系統(tǒng)自帶軟件Gelpro 32 分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內(nèi)參照（GAPDH）灰度面積的乘積反映相對(duì)蛋白表達(dá)豐度。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 11.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，組間差異顯著性比較采用t 檢驗(yàn)，P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 不同濃度芹菜素于不同作用時(shí)間對(duì) A549 細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

表1 不同濃度芹菜素于不同作用時(shí)間對(duì) A549 細(xì)胞增殖的抑制率（%，，n = 3）Table1 Inhibition of A549 cells after different time points of incubation with API at various concentrations (%,, n = 3)

注：與空白對(duì)照組比較，**P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

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圖1 Hoechst 33258 染色觀察細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化（× 100）Figure1 Morphological changes of the nucleus of A549 cells were observed by Hoechst 33258 staining (× 100)

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果見表 1，以芹菜素不同濃度（10、20、40、80 μmol/L）和不同時(shí)間（24、48、72 h）處理 A549細(xì)胞后，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P < 0.01），當(dāng)同一芹菜素濃度作用時(shí)間逐漸延長或同一作用時(shí)間芹菜素濃度逐漸升高時(shí)，對(duì) A549 細(xì)胞的增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，呈濃度和時(shí)間依賴性。

2.2 芹菜素誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化

以 10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 A549 細(xì)胞24 h 后，在熒光顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞皺縮，出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變（如箭頭所示），見圖 1B ～ E。而空白對(duì)照組以活細(xì)胞為主，核呈圓形或橢圓形，為藍(lán)色均勻淡染，細(xì)胞核膜完整，未見凋亡細(xì)胞，見圖 1A。

表2 不同濃度芹菜素作用 24 h 對(duì) A549 細(xì)胞凋亡率的影響（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

表2 不同濃度芹菜素作用 24 h 對(duì) A549 細(xì)胞凋亡率的影響（%，，n = 3）Table2 Apoptotic rate of A549 cells induced by API at various concentrations after 24 h (%,s, n = 3)

注：與空白對(duì)照組比較，P < 0.01。Note:**P < 0.01 vs. control group.

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圖2 不同濃度芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞凋亡率的影響Figure2 Apoptotic rate of A549 cells induced by incubation with API

2.3 芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用

芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用結(jié)果見表 2、圖 2，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 24 h 后，細(xì)胞凋亡率隨著芹菜素濃度的升高逐漸增加，與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異（P < 0.01）。提示芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)具有濃度依賴性。

2.4 芹菜素誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變

結(jié)果見圖 3，10 ～ 80 μmol/L 芹菜素處理 24 h后，促凋亡蛋白 Bax 隨著芹菜素濃度升高表達(dá)逐漸增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 隨著芹菜素濃度升高表達(dá)逐漸減少。對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，隨芹菜素濃度升高，Bax/Bcl-2 比值逐漸增大，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05，P < 0.01），見圖 4。此結(jié)果提示芹菜素可能通過上調(diào) Bax 和下調(diào) Bcl-2 蛋白表達(dá)誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡。

圖3 芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞 Bax 和 Bcl-2 表達(dá)的影響Figure3 Expression of Bax and Bcl-2 in A549 cells after API treatment

圖4 Bax 和 Bcl-2 蛋白表達(dá)比值（與空白對(duì)照組相比，*P < 0.05；**P < 0.01）Figure4 Ratio of the expression of Bax and Bcl-2 (*P < 0.05;**P < 0.01 vs. control)

3 討論

細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，維持著正常組織的生長平衡。如果打破這種平衡，凋亡受抑，細(xì)胞死亡率降低，機(jī)體不能重新恢復(fù)調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出生長優(yōu)勢(shì)最終形成腫瘤。細(xì)胞凋亡受到抑制有可能導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡則可以促使腫瘤的消退。

芹菜素作為一種植物提取的活性成分，具有資源豐富，毒性低的優(yōu)點(diǎn)，大量研究表明，芹菜素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有抑制作用，但有關(guān)芹菜素抗肺癌作用研究鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)首先使用不同濃度芹菜素作用 A549 細(xì)胞不同時(shí)間，MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芹菜素呈濃度和時(shí)間依賴性地抑制 A549 細(xì)胞增殖。通過 Hoechst 33258 細(xì)胞核染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了芹菜素可呈濃度依賴性地誘導(dǎo)人肺癌 A549 細(xì)胞凋亡。

芹菜素對(duì)癌細(xì)胞促凋亡作用是通過多種途徑實(shí)現(xiàn)的，其中包括參與癌細(xì)胞凋亡基因調(diào)控，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期，干擾信號(hào)傳導(dǎo)等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素可呈濃度依賴性地下調(diào)抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)促凋亡蛋白 Bax 表達(dá)，我們推測(cè)芹菜素誘導(dǎo) A549 凋亡的機(jī)制可能與上調(diào) Bax 和下調(diào) Bcl-2 的表達(dá)，導(dǎo)致 Bax/Bcl-2比值增加。但由于細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)非常復(fù)雜，對(duì)芹菜素抗肺癌機(jī)制仍需更進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芹菜素作為一種天然存在的黃酮類化合物，能夠抑制人肺癌 A549 細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，可為芹菜素應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of apigenin on apoptosis an d expression of Bax and Bcl-2 in A549 human lung cancer cells

PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, YANG Zhi-ying, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang

Objective To investigate the effect of apigenin on proliferation, and apoptosis, as well as Bax and Bcl-2 protein expression in human lung cancer cell line A549.Methods A549 cells cultured in vitro were treated with 10 ～ 80 μmol/L different concentration of apigenin. MTT was used to detect the inhibitory rates according to the formula. Apoptosis of A549 cells was observed in a fluorescence microscope by Hoechst 33258 staining and quantified by flow cytometry using annexin V-FITC/PI staining. The expressions of apoptosis-related protein Bax and Bcl-2 were analyzed by Western blot.Results The inhibition of proliferation by apigenin was concentration-dependent and time-dependent. A549 cells treated with apigenin showed significant morphological changes in different apoptotic phases. The apoptotic rate was concentration-dependently increased. Western blot analysis indicated that apigenin increased the protein level of Bax, and reduced the protein level of Bcl-2.Conclusion Apigenin can inhibit proliferation and induce apoptosis of human lung cancer cell line A549, which might be related with up-regulated expression of Bax and down-regulated expression of Bcl-2.

Apigenin; Lung neoplasms; Cell proliferation; Apoptosis; bcl-2-associated X protein; Proto-oncogene proteins c-bcl-2

WANG Gui-xiang, Email: wgx306@yahoo.com.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.04.004

國家自然科學(xué)基金（81102465）；“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項(xiàng)（2011zx09102-001-31）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010B031 500034）；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2010J-E091）

510006 廣州，廣東藥學(xué)院藥科學(xué)院藥理系新藥篩選與藥效學(xué)評(píng)價(jià)中心（潘雪刁、楊周萍、周四桂、臧林泉、王桂香）；518035 深圳市第二人民醫(yī)院營養(yǎng)科（楊志英）

王桂香，Email：wgx306@yahoo.com.cn

2013-06-25

方法 10 ～ 80 μmol/L 不同濃度芹菜素作用 A549 細(xì)胞，采用 MTT 法檢測(cè)芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞增殖抑制作用；Hoechst 33258 細(xì)胞核染色法觀察芹菜素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的變化；流式細(xì)胞儀 AnnexinV- FITC/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western blot 法檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白 Bax 和 Bcl-2表達(dá)的變化。

結(jié)果 MTT 法顯示，芹菜素對(duì) A549 細(xì)胞有顯著的增殖抑制作用（P < 0.01），且具濃度和時(shí)間依賴性；熒光顯微鏡下觀察到芹菜素處理組細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞核固縮、染色質(zhì)凝集和核碎片化等；流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，芹菜素呈濃度依賴性誘導(dǎo) A549 細(xì)胞凋亡；Western blot結(jié)果顯示，促凋亡蛋白 Bax 隨著芹菜素濃度升高表達(dá)增加，抗凋亡蛋白 Bcl-2 隨著芹菜素濃度升高表達(dá)減少。

結(jié)論 芹菜素具有抑制人肺癌 A549 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡的作用，其機(jī)制可能與上調(diào) Bax 蛋白表達(dá)和下調(diào) Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

Author Affiliations: New Drug Screening and Pharmacodynamics Evaluation Center, Department of Pharmacology, College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China (PAN Xue-diao, YANG Zhou-ping, ZHOU Si-gui, ZANG Lin-quan, WANG Gui-xiang); Nutritional Department, The Second People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518035, China (YANG Zhi-ying)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2013, 8(4):259-263