邵 杰，吳 星，梁爭論

Toll樣受體研究與疫苗研發(fā)

邵 杰，吳 星，梁爭論

疫苗是控制傳染病的主要手段，但目前疫苗的研發(fā)仍然處于經(jīng)驗階段，多數(shù)疫苗的免疫機制尚不十分清楚，傳統(tǒng)疫苗的研發(fā)思路在新型 HIV、HCV 等疫苗的研發(fā)中遭遇瓶頸，難以取得突破。Toll 樣受體（TLRs）是模式識別受體（pattern recognition receptor，PRRs）的一種。TLRs 信號通路的激活，不僅誘導機體產(chǎn)生炎癥反應，同時也促進 DC的成熟與 Th 細胞的分化，進而產(chǎn)生獲得性免疫應答，因此有研究認為其處于溝通固有免疫與獲得性免疫的核心地位[1]。研究表明，同時激活多條 TLRs 通路的疫苗具有更好的免疫效果，黃熱疫苗的高免疫原性與其可同時激活樹突狀細胞（DC）多條 TLRs 通路相關[2]。在對麻疹、風疹、乙肝等疫苗免疫應答機制的研究中，也均發(fā)現(xiàn)存在特異激活的 TLRs 信號通路。TLRs 與下游接頭分子的單核苷酸多態(tài)性，可影響乙肝、麻疹等疫苗效果，可能是該疫苗免疫無應答及低應答現(xiàn)象產(chǎn)生的原因。由于 TLRs 在誘導固有免疫的重要作用，目前研發(fā)的新型疫苗佐劑幾乎均為 TLRs 的配體[3]。對 TLRs 作用機制的研究有助于深入認識疫苗的免疫機制，改進疫苗研發(fā)和評價的思路。本文對 TLRs 在疫苗免疫機制研究中的進展進行綜述。

1 TLRs 概述

TLRs 為模式識別受體的一個重要家族，在宿主免疫細胞對微生物病原體識別以及應答過程中起到重要作用。Toll蛋白最早由法國科學家 Hoffmann 于 1996 年在研究果蠅時首先發(fā)現(xiàn)，該蛋白可識別病原微生物并激活機體的先天免疫，其研究成果發(fā)表在當年的 Cell 雜志上[4]。兩年后，美國科學家 Beutler 證實哺乳動物小鼠中也存在類似的基因，且編碼的受體蛋白同樣能激活機體的天然免疫[5]。由于發(fā)現(xiàn)了 TLRs，兩位科學家獲得了 2011 年的諾貝爾醫(yī)學或生理學獎。至今為止，人類已被確認的 TLRs 有 11 種，小鼠有 13 種[6]。TLRs 主要在固有免疫細胞表達，包括：DC、肥大細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、纖維母細胞等[7-12]；以及獲得性免疫細胞，如：T 淋巴細胞、B 淋巴細胞等[13]。此外，在一些神經(jīng)細胞中也發(fā)現(xiàn) TLRs 表達[14]。不同的 TLRs 在細胞上的位置不同：TLR 1、2、4、5 和6 位于細胞表面，而 TLR 3、7、8 和 9 則主要位于細胞內(nèi)[8, 10]。

目前發(fā)現(xiàn)的 TLRs 皆為 I 型跨膜蛋白，膜外包含一個不同長度的富含亮氨酸的重復序列（LRR domain）；膜內(nèi)包括一個與白介素-1 受體（IL-1R）同源的結構域（TIR domain）[15]。TLRs 的胞外區(qū)之間存在較大的差異性，如人的 TLR2 和 TLR4 的胞外區(qū)僅有 24% 同源，這可能是不同配體激活不同受體的結構基礎。不同種屬 TLRs 基因胞外區(qū)也存在顯著差異，例如人和小鼠的 TLR4 胞外區(qū)僅53% 相同，而胞質(zhì)區(qū)同源性為 83%，可能是不同生物對相同病原體侵襲反應不同的機制之一[16]。

TLRs 可以廣泛地識別許多細菌、真菌以及病毒的保守結構，不同的 TLRs 識別特異的配體。一般認為：TLR1或 TLR6 與 TLR2 協(xié)同識別脂肽類（lipopeptides）；TLR3的配體為雙鏈的 RNA；TLR4 的配體為細菌脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）；TLR5 的配體為鞭毛蛋白（flagellin）；TLR7 與 TLR8 的配體為單鏈 RNA 分子；TLR9 的配體為細菌或病毒的非甲基化 CpG 序列[14]。隨著對 TLRs 認識的不斷深入，一些新的 TLR 配體被不斷發(fā)現(xiàn)，2011 年 Kawai 與 Akira[6]對 TLRs 識別的 PAMP 重新進行了總結（表 1）。

表1 TLRs 識別的病原體相關分子模式

大多數(shù)關于 TLRs 信號通路的信息是通過對 HEK 293細胞過表達體系以及 TLR 基因敲除小鼠的研究獲得的[14]。TLRs 信號通路的激活不僅誘導機體產(chǎn)生炎癥反應，同時也促進 DC 的成熟與 Th 細胞的分化，進而產(chǎn)生獲得性免疫應答[17]。TLRs 信號通路可簡要概括為：特異配體與相應的 TLR 結合，使得 TLRs 活化；TLR 的活化可激活MyD88、MAL、TRIF、TRAM 和 SARM[11,18]等中間調(diào)控因子；這些中間調(diào)控因子的激活最終引起轉(zhuǎn)錄因子 IRF3、IRF7、AP-1 和 NF-κB 等活化；炎癥因子 TNF-β、IL-6、IL-1β 和 IL-12 等基因表達增強；協(xié)同刺激分子，如：DC 表面的 CD80、CD86 和 CD40 表達上調(diào)，從而活化 DC?；罨?DC 可產(chǎn)生不同的細胞因子和化學激活因子，如：TLR2 刺激 DC 優(yōu)先表達 IL-8 和IL-23，TLR4 主要刺激產(chǎn)生 IL-12p70，IFN-γ 介導蛋白（IP210）及 IFN-β。這些可溶性細胞因子誘導 T 輔助細胞（Th）向有利于清除病原體的方向分化，進而產(chǎn)生獲得性免疫應答[19-21]。

2 TLRs 與疫苗免疫機制的研究

目前上市的疫苗包括：減毒活疫苗、滅活疫苗和重組蛋白疫苗三種。減毒活疫苗是指毒力被減弱的菌株或病毒株，可在機體內(nèi)生長繁殖，但不會引起疾病發(fā)生。當其進入體內(nèi)后，可以與自然感染天然病原體一樣激活 PRR 通路，誘導機體產(chǎn)生固有免疫，然后增殖進入主動免疫部位，被 DC 或其他抗原提呈細胞（APC）捕獲并轉(zhuǎn)移至淋巴器官，將抗原呈遞給 B 與 T 淋巴細胞，產(chǎn)生獲得性免疫應答。Leavy[22]認為同時激活多條 TLRs 通路的疫苗具有更好的免疫效果，比如黃熱減毒活疫苗 YF-17D，可同時通過 TLR 2、7、8、9 途徑活化 DC，促使 DC 分泌促炎癥因子(IL)-12p40、IL-6、INF-α，進而引起多種不同的獲得性免疫應答反應[2]。

滅活疫苗是指培養(yǎng)獲得的病原微生物經(jīng)甲醛或加熱等方式滅活后制備成的疫苗。有效成分是滅活病原體顆粒，在體內(nèi)無法增殖。雖然也有報道指出某些滅活疫苗可激活特異的 TLRs 通路，目前仍普遍認為其激活 PRR 的能力較差，需要添加佐劑以獲得更好的疫苗免疫效果[17]。

重組蛋白疫苗指運用 DNA 重組技術，把病原微生物的遺傳物質(zhì)定向插入細菌、酵母菌或哺乳動物細胞等表達體系中表達，收獲表達產(chǎn)物純化制成的疫苗?；蚬こ桃呙缈赏ㄟ^ TLRs 啟動有效疫苗免疫應答，并且不同表達系統(tǒng)或不同構建模式疫苗可誘導不同的 TLRs 應答。Mizukoshi等[23]發(fā)現(xiàn)酵母表達的 HIV VLP 通過 DCs 的 TLR2 誘導免疫應答，而 Aricò 等[24]發(fā)現(xiàn)桿狀病毒表達的 HIV-1 Pr55gag VLPs 則通過 DCs TLR3 和 TLR9 誘導疫苗免疫應答。一般認為基因工程疫苗刺激機體識別“非己”的能力較差，導致較差的免疫活性，為提高其免疫效率，一些研究者將目光放在了研究新型佐劑和運載系統(tǒng)中[25]。

3 TLRs 與新型疫苗佐劑

新型疫苗佐劑的研發(fā)與應用是近些年來疫苗學中的一個研究熱點，目前研發(fā)的新型疫苗佐劑幾乎皆為TLRs 的配體[3,26]。與目前廣泛使用的傳統(tǒng)鋁佐劑相比，TLR 配體型佐劑存在明顯優(yōu)勢：TLRs 配體能夠溝通固有免疫與獲得性免疫，同時降低直接由炎癥反應引起的不良反應；與鋁佐劑主要激活 Th2 介導的免疫應答反應不同，TLR 配體型佐劑可同時激活 Th1、Th3（T-reg）介導的免疫通路，作用更加全面[27-28]。對 TLR 配體型佐劑的研發(fā)主要通過對天然TLRs 配體進行化學修飾或由人工合成小分子配體實現(xiàn)。

目前較為成功的 TLR 配體型佐劑包括：單磷酰脂 A（monophosphoryl lipid A，MPL）為 TLR4 配體，可激活TRAM 和 TRIF 信號通路，起到與 LPS 相似的效果，同時明顯減弱促炎癥的 MYD-88 依賴的信號通路[29]。MPL還能促進 Th1 應答，促進細胞免疫，因此在許多疫苗的研發(fā)中都將其作為一個最可能的佐劑，在瘧疾、結核、艾滋以及利什曼病疫苗的研發(fā)中皆有類似的報道[27]。MPL 經(jīng)氫氧化鋁或磷酸鋁吸附后，稱為 AS04 佐劑，已經(jīng)在預防性的乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、單純皰疹病毒（HSV）疫苗、艾巴病毒（EBV）疫苗、諾瓦克病毒（NLV）疫苗上進行了評價，葛蘭素史克公司生產(chǎn)的添加了 AS04 佐劑的乙肝疫苗 Fendrix 已在歐盟獲得批準[30-34]。與之相似的TLR4 配體佐劑還有：用于預防性乙肝疫苗的 RC-529 佐劑，已在阿根廷獲得批準[35]；E6020 佐劑，主要激活 Th1 型體液免疫途徑，作為三價流感疫苗與腦膜炎疫苗的佐劑，表現(xiàn)出良好的安全性與有效性[36-37]。TLR3 配體佐劑 POLY（I?C）為一段人工合成的雙鏈 RNA 分子類似物，可激活Th1 介導的細胞免疫應答，作為重組 H5N1 流感疫苗佐劑，在攻毒小鼠上起到了良好的保護效果[38]。TLR5 配體佐劑鞭毛蛋白，可激活 NF-κB 信號通路，鞭毛蛋白作為滅活流感疫苗的佐劑，能夠有效保護攻毒小鼠[39]。關于 TLR7，8 配體佐劑咪唑喹啉可增強 Th1 介導的體液與細胞免疫也有報道[40-41]。另一種獲得批準的 TLR 配體佐劑為非甲基化的CpG，它是 TLR9 的配體，已獲準應用于炭疽疫苗中[42]。

4 TLRs 多態(tài)性影響疫苗免疫效果

隨著分子生物學技術的發(fā)展，以基因組學、蛋白組學為代表的一些高通量技術應用于疫苗學的研究中，TLR 基因多態(tài)性與疫苗免疫效果間的關系也得以揭示。Chen 等[43]對乙肝疫苗無應答人群與正常應答人群的遺傳信息進行了比較，發(fā)現(xiàn)兩組人群間 TLR2 基因存在差異，認為 TLR2基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP），很可能是兩組人群對同一種乙肝疫苗的免疫應答出現(xiàn)差異的原因。Dhiman 等[44]對麻疹疫苗研究發(fā)現(xiàn)，TLR3 以及其下游的胞內(nèi)信號分子MYD88 和 MD2 基因 SNP 與麻疹疫苗體液及細胞免疫水平皆相關；TLR4 基因 SNP 可能導致機體感染麻疹疫苗株后，IL-4 分泌水平發(fā)生變化。在風疹疫苗的研究中也有類似報道，Ovsyannikova 等[45]發(fā)現(xiàn) TLRs 以及維生素A、D 受體的 SNP 與接種疫苗后獲得性免疫相關細胞因子表達水平相關。接種百日咳疫苗的考拉幼崽血清中和抗體水平同樣受到 TLR4 啟動子區(qū)域及其下游信號分子基因型的影響[46]。TLRs 基因 SNP 影響疫苗免疫效果，不僅從側面證實了 TLRs 在疫苗免疫應答中發(fā)揮重要作用，也為疫苗低應答與無應答現(xiàn)象提供了一種解釋。

5 結語

新型疫苗研發(fā)時間漫長且風險巨大，在疫苗研發(fā)階段科學預測疫苗免疫效果以及安全性是疫苗企業(yè)縮短研發(fā)周期、降低研發(fā)成本的有效途徑。近年來各種基因、蛋白等組學技術和免疫學研究進展迅速，為依據(jù)固有免疫應答預測疫苗的安全性和免疫效果提供了基礎。TLRs 在疫苗誘導的固有免疫應答中發(fā)揮關鍵作用，為新型疫苗佐劑研究的重點，因此開展 TLRs 在疫苗應答中作用的研究對促進疫苗學的發(fā)展具有重要意義。

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2013-05-06