張 媛 徐 紅 楊汝春 周法根（指導） 浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院 杭州 310007

侯小青 浙江中醫(yī)藥大學

·實驗研究·

復方芪苓無糖顆粒對高脂致血管內皮細胞損傷的保護作用

張 媛 徐 紅 楊汝春 周法根（指導） 浙江中醫(yī)藥大學附屬廣興醫(yī)院 杭州 310007

侯小青 浙江中醫(yī)藥大學

目的：觀察復方芪苓無糖顆粒對高脂損傷血管內皮細胞的保護作用，探討其治療高脂血癥的作用機制。方法：用高脂血清造成人血管內皮細胞（EVC）損傷模型，以復方芪苓無糖顆粒及血脂康含藥血清進行干預。光鏡下觀察細胞形態(tài)變化，MTT法檢測細胞活性；采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）技術檢測復方芪苓無糖顆粒高、中、低劑量各組對高脂血清誘導的血管內皮細胞表面黏附分子（TGF-β1）基因表達。結果：復方芪苓無糖顆粒各劑量組及血脂康組均能使高脂損傷的EVC形態(tài)趨于正常，活性增強，細胞膜損傷減輕；并均有上調內皮細胞TGF-β1的趨勢，血脂康組TGF-β1表達與復方芪苓顆粒中、高濃度組比較無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論：復方芪苓無糖顆粒對高脂損傷的血管內皮細胞有保護作用，可能是其防治高脂血癥及動脈粥樣硬化的作用機制之一。

血管內皮細胞損傷 高脂血癥 復方芪苓無糖顆粒 轉化生長因子-β1

動脈粥樣硬化發(fā)病機制復雜，諸多因素參與，血管內皮細胞損傷作為始動環(huán)節(jié)已被公認。本研究以高脂血清造成人血管內皮細胞（EVC）損傷模型，以復方芪苓無糖顆粒及血脂康含藥血清進行干預，觀察復方芪苓無糖顆粒對內皮細胞的保護作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 復方芪苓無糖顆粒（組成：黃芪、土茯苓、丹參、秦艽等；功效：健脾化痰，益氣活血）由杭州市中醫(yī)院制劑室提供；血脂康膠囊由北京北大維信生物科技有限公司生產；胰蛋白酶由GIBCO公司杭州吉諾生物公司分裝；M199培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS緩沖液由杭州四季青公司提供；MTT、DMSO由美國SIGMA公司生產杭州達文生物公司分裝；Trizol試劑盒、10×PCR buffer、Taq酶、DNTP Mix、ICAM-1引物序列、TGF-β1引物序列、β-actin引物序列由上海生工生物有限公司提供。

1.2動物與細胞 清潔級成年雄性SD大鼠，體質量（160g±20）g，由浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK（浙）2008-0115。細胞株由浙江中醫(yī)藥大學提供。

1.3 血清制備 成年雄性SD大鼠20只，常規(guī)飼養(yǎng)1周后隨機分正常組、高脂組、復方芪苓顆粒組和血脂康組，每組5只。正常組大鼠予標準飼料，高脂組、復方芪苓顆粒組、血脂康組按高脂飼料配方（豬油15%+膽固醇6%+膽鹽3號2%+丙基硫氧嘧啶0.2%），10mL/kg的容量灌胃，每天1次（12：00）。第19天起復方芪苓顆粒組、血脂康組在灌高脂飼料的同時灌胃給藥，每天灌胃量分別為1.6g、0.25g，2mL/次，每天8、16時灌胃，共3天。各組大鼠連續(xù)灌胃21天，灌胃期間高脂組和藥物組大鼠自由攝取常規(guī)飼料，末次灌胃后1h從腹主動脈取血。離心后各取血清0.5mL送檢，檢測血脂水平，剩余血清超濾，56℃水浴滅活30min，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細胞培養(yǎng) 用膠原酶消化法分離人血管內皮細胞；加6mL含10%FCS的M199培養(yǎng)液將細胞打勻，轉移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。吸凈培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，每瓶加入1mL10倍胰酶、3mL PBS；37℃、消化5～7min，用指尖輕叩瓶底，以細胞脫落瓶底為宜，加入含10%FCS的M199終止消化；用吸管將細胞充分吹打下來，轉移至15mL離心管，4℃、1 000轉離心5min；去上清，加入M199液洗滌1次，離心；去上清后，加入含10%FCS M199培養(yǎng)液10mL，吹打成細胞懸液，各取5mL分別加入50mL培養(yǎng)瓶中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育，2天換液1次，待細胞長到90%融合時傳代培養(yǎng)。實驗取第六代細胞。

1.5 實驗分組 將接種細胞隨機分為正常對照組（10%正常大鼠血清）、高脂組（10%高脂大鼠血清）、復方芪苓無糖顆粒低濃度組（7.5%高脂血清和2.5%復方芪苓顆粒血清）、復方芪苓無糖顆粒中濃度組（5%高脂血清和5%復方芪苓顆粒血清）、復方芪苓無糖顆粒高濃度組（10%復方芪苓顆粒血清）、血脂康組（5%高脂血清和5%血脂康血清），每組設6個平行孔。

1.6 檢測指標

1.6.1 EVC形態(tài)學觀察 各組藥物血清作用呈單層EVC 24h后，倒置顯微鏡下觀察EVC形態(tài)變化。

1.6.2 MTT法檢測細胞增殖 將80%融合生長的內皮細胞以10倍胰酶消化，收集細胞，含10%FCS的M199培養(yǎng)液稀釋后以2×104/L的密度接種于96孔板。正常培養(yǎng)24h后，洗去未貼壁細胞。換用無血清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細胞同步化。同步24h后換用含不同濃度高脂血清的M199培養(yǎng)液，即低濃度高脂血清刺激組：用7.5%正常大鼠血清和2.5%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；中濃度高脂血清刺激組：用5%正常大鼠血清和5%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)；高濃度高脂血清刺激組：用10%高脂血清的M199培養(yǎng)液培養(yǎng)。并設空白對照組（含10%正常大鼠血清的M199培養(yǎng)基）及調零孔（10%胎牛血清培養(yǎng)基、MTT、DMSO）。分別培養(yǎng)24h、48h后移出培養(yǎng)液，換入無血清M199培養(yǎng)液100μL/孔，并于每孔加MTT（5g/L）10μL。繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸棄原培養(yǎng)液，每孔中加入DMSO100μL，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，并于酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處檢測光密度值（OD值）。

1.6.3 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測TGF-β 1基因表達 依照Trizol試劑盒說明書提取總RNA，根據(jù)康為逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，用逆轉錄后的cDNA產物做模板擴增TGF-β1產物。取PCR產物10μL，加入10×Loading Buffer 2μL，混勻后加到凝膠孔中，將電泳儀電壓調至80伏，電泳15～20min，用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，用 Bio Rad quan?ity one軟件對條帶進行半定量分析,TGF-β1 mRNA的相對含量分別用其與β-actin特異性條帶的積分光密度比值表示。每組實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA），組間用LSD法做比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 復方芪苓無糖顆粒及血脂康對高脂血清處理的EVC形態(tài)學的影響 正常對照組細胞相差顯微鏡下為單層，互不重疊呈鋪石灰鑲嵌排列，細胞呈多角型，邊界清楚；高脂組細胞間隙增寬，細胞收縮變圓，細胞邊界不清，部分細胞脫落；復方芪苓及血脂康干預組細胞間隙變窄，形態(tài)趨于正常。

2.2 高脂血清對血管內皮細胞增殖的影響 48h各濃度高脂血清刺激組與空白對照組比較，OD值無明顯變化（P＞0.05）；24h各濃度高脂血清刺激組與空白對照組比較，OD值明顯增加（P＜0.05）；高濃度組OD值增加最明顯，與低、中濃度組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 高脂血清對血管內皮細胞增殖的影響（±s）

表1 高脂血清對血管內皮細胞增殖的影響（±s）

注：與空白對照組比較，▲P＜0.05；與低、中濃度組比較，△P＜0.05

組別空白對照組低濃度高脂血清刺激組中濃度高脂血清刺激組高濃度高脂血清刺激組n5555 24h 1.45±0.03 1.48±0.09▲1.43±0.19▲1.76±0.11▲△48h 1.61±0.04 1.60±0.06 1.64±0.07 1.58±0.20

2.3 復方芪苓顆粒對高脂血清誘導的內皮細胞TGF-β1mRNA表達的影響 高脂組與正常對照組比較TGF-β1顯著降低（P＜0.05）；復方芪苓顆粒低、中、高濃度組、血脂康組均有上調內皮細胞TGF-β1的趨勢，中、高濃度組與高脂組比較，TGF-β1顯著升高（P＜0.05）；血脂康組能顯著上調內皮細胞TGF-β 1的含量（P＜0.05），見表2。

表2 復方芪苓顆粒對內皮細胞TGF-β1 mRNA的影響（±s）

表2 復方芪苓顆粒對內皮細胞TGF-β1 mRNA的影響（±s）

注：與正常對照組比較，▲P＜0.05；與高脂組比較，*P＜0.05

n TGF-β1/β-actin組別333333 0.18±0.03 0.08±0.03▲0.11±0.07▲0.23±0.05▲* 0.25±0.05▲* 0.23±0.08▲*正常對照組高脂組復方芪苓顆粒低濃度組復方芪苓顆粒中濃度組復方芪苓顆粒高濃度組血脂康組

3 討 論

已有研究證明，復方芪苓顆粒能顯著降低高脂血癥大鼠TC、TG及LDL-C，提高HDL-C[1]；復方芪苓顆粒含藥血清能顯著抑制TNF-α刺激血管內皮細胞 ICAM-1 mRNA的表達 ，從基因水平闡明了復方芪苓顆粒對TNF-α誘導內皮細胞ICAM-1 mRNA的表達的抑制作用,從體外實驗證明復方芪苓顆粒含藥血清抑制 ICAM-1表達的作用是減輕 TNF-α誘導的人血管內皮細胞炎癥損傷的機制之一[2]。本實驗以高脂血清作用于EVC，造成內皮細胞損傷模型，光鏡下可見細胞間隙增寬，細胞收縮變圓，細胞邊界不清，部分細胞脫落；而復方芪苓無糖顆粒各劑量組及血脂康組可以使高脂血清造成的細胞形態(tài)學改變趨于正常。MTT比色法測定EVC活性結果表明，高脂血清明顯抑制EVC的活性。TGF-β1是TGF-β眾多成員中的一種，在哺乳動物體細胞中所含的比例最高（＞90%）、活性最強，與疾病關系最密切。目前普遍認為TGF-β1是AS的保護性細胞因子。研究[3]表明，TGF-β1在心血管方面的主要生物作用有：①對血管內皮細胞的遷移及增殖呈促進或抑制的雙相性；②調節(jié)細胞外基質蛋白，增加纖維連接蛋白、蛋白聚糖和膠原蛋白合成，阻止基質蛋白降解。所以，TGF-β1在動脈硬化過程中作用是雙向性的，既抑制動脈粥樣斑塊又有參與再狹窄的可能。本實驗結果顯示，復方芪苓無糖顆粒中、高濃度干預組TGF-β1較高脂組均有顯著提高，提示中藥復方芪苓無糖顆?？赡芡ㄟ^提高內皮細胞TGF-β1的含量降低高脂環(huán)境下巨噬細胞的表達，從而降低清道夫受體的表達，使膽固醇成分減少，上調ATP結合轉運載體使膽固醇外流增加，同時抑制由氧化的極低密度脂蛋白殘基誘發(fā)的泡沫細胞的形成，起到抗粥樣硬化的作用。

［1］徐紅，張媛，楊汝春，等.復方芪苓無糖顆粒劑對高脂血癥大鼠脂質代謝紊亂調節(jié)的研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2012，27（11）：2982-2985.

［2］徐紅，楊汝春，王軍，等.尿酸利仙含藥血清對TNF-α誘導的人血管內皮細胞ICAM-1基因表達的影響［J］.中醫(yī)藥學刊，2006.8，24（8）：1451.

［3］鄭瓊莉，祝煒，賈晶，等.轉化生長因子β1與心血管疾?。跩］.中國心血管病研究志雜，2006，4（7）：550-551.

ProtectiveEffectsofSugar-freeQilingCompoundGranulesonEndothelialVascularCellsAgainstInju?riesInducedbyHyperlipidemicSerum

Z HANGY u a n,XUH o n g,HOU X i a o-q i n g,e t a l.G u a n g x i n g H o s p i t a l Affiliated to Zhejiang Traditional Chinese Medicine University,Hangzhou(310007)，China

Objective:To study the protective effect of sugar-free Qiling compound granules on endothelial vascu?lar cells(EVC)against injuries by hyperlipidemic serum,in an attempt to understand the underlying mechanism of sugar-free Qiling compound granules in treating hyperlipidemia.M ethods:Hyperlipidemic serum was used to establish injured model of EVC.Sera with sugar-free Qiling compound granules of low,medium,high concentra?tions and Xuezhikang were applied with hyperlipidemic serum together.The morphologic changes of EVC were ob?served under light microscope and EVC activity was determined by MTT method.Reverse transcription-poly?merase chain reaction(RT-PCR)technique was used to detect hyperlipidemia induced EVC surface adhesion mole?cule(TGF-β1)gene expression in 3 Qiling groups.Results:After treatment of 3 doses of Qiling compound and Xuezhikang,abnormal morphologic changes of EVC induced by hyperlipidemic serum gradually retained to nor?mal,the activity of EVC increased,and the injury of cell membrane lessened.The mRNA’s expression of TGF-β 1 in all groups increased after treatment and the expression was not statistically different between the Xuezhi?kang group and the sugar-free Qiling groups with medium and high concentrations(P＞0.05).Conclusion:Sug?ar-free Qiling compound granules have a protective effect on EVC against injuries induced by hyperlipidemic se?rum and can be used as prevention and treatment for hyperlipidemia and atherosclerosis ideal medication.

endothelial vascular cell injury hyperlipidemia sugar-free Qiling compound granules transforming growth factor-β1

2012-10-25

浙江省中醫(yī)藥科研計劃項目（No.2008CA080）

張媛，E-mail：xiamo0405@msn.com.