鄭明警 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

馬麗俐 浙江省中醫(yī)院

大青葉等清熱藥對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

鄭明警 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 杭州 310053

馬麗俐 浙江省中醫(yī)院

目的：觀察單味清熱類中藥大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響。方法：用MTT法檢測(cè)上述單味清熱類中藥提取物對(duì)HaCat細(xì)胞的24h抑制率。結(jié)果：大青葉、龍膽草、黃芩、生地提取物具有抑制HaCaT細(xì)胞增殖作用，且與藥物濃度具有一定相關(guān)性；水牛角提取物具有促進(jìn)HaCaT細(xì)胞增殖作用，且與藥物濃度具有一定相關(guān)性，與空白對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論:抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖可能是大青葉、生地、黃芩、龍膽草治療銀屑病的作用機(jī)制之一，水牛角治療銀屑病的作用與抑制角質(zhì)形成細(xì)胞增殖無關(guān)。

銀屑病 HaCaT細(xì)胞 清熱類中藥

銀屑病是一種慢性復(fù)發(fā)性皮膚疾病。病理學(xué)表現(xiàn)為表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖[1-3]及異常分化，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，真皮血管增生。臨床表現(xiàn)為紅色斑塊，覆有多層銀白色的鱗屑。角質(zhì)形成細(xì)胞功能改變?cè)阢y屑病的發(fā)病中具有重要作用[3]。HaCaT細(xì)胞是成人皮膚中分離得到的一種永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞株，與正常人角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、分化特性相似，遺傳特性穩(wěn)定，現(xiàn)常用來替代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究[4]。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察清熱類中藥大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩提取物對(duì)HaCaT的增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 HaCaT細(xì)胞由浙江省中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供，大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩中藥提取物購(gòu)自浙江省中藥研究所，1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hylcone，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司，0.25%含EDTA胰酶購(gòu)自吉諾公司，rhEGF購(gòu)自Sino Biological Inc。

1.2 HaCaT細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃ CO2培養(yǎng)箱，定時(shí)換液、傳代培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測(cè)HaCaT細(xì)胞增殖 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HaCaT細(xì)胞以1×104/孔密度接種至96孔板，置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h后，換含20ng/mL的rhEGF的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，設(shè)空白對(duì)照組、大青葉、生地、龍膽草、生地、黃芩五個(gè)加藥組，加藥組換1640稀釋藥物配成的培養(yǎng)液，每一個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔（統(tǒng)計(jì)結(jié)果時(shí)去掉最高和最低值）。24h后，每孔MTT（5mg/ mL）20μL，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，2000rpm離心10min，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，置細(xì)胞板蕩器振蕩10min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490nm處測(cè)量各孔的吸光值（OD值）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用方差分析。

表1 大青葉提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

表1 大青葉提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組大青葉提取物組n333333濃度/（mg/mL）081 6 24 32 40 OD值0.412±0.060 0.284±0.010△0.304±0.008△0.235±0.012△0.120±0.012△0.100±0.013△

表2 龍膽草提取物對(duì)HaCat細(xì)胞增殖的影響（±s）

表2 龍膽草提取物對(duì)HaCat細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組龍膽草提取物組n333333濃度/（mg/mL）0 10 20 30 40 50 OD值1.096±0.011 0.960±0.016△0.831±0.007△0.531±0.008△0.379±0.009△0.110±0.010△

表3 水牛角提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

表3 水牛角提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組水牛角提取物組n3333濃度/（mg/mL）0 70 80 90 OD值0.467±0.008 0.519±0.007△0.686±0.005△0.857±0.013△

表4 黃芩提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

表4 黃芩提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響（±s）

注：與空白對(duì)照組比較，△P＜0.05

組別空白對(duì)照組黃芩提取物組n333333濃度/（mg/mL）0 50 60 70 80 90 OD值1.257±0.007 0.414±0.006△0.357±0.005△0.331±0.003△0.325±0.006△0.301±0.008△

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

大青葉、龍膽草、黃芩、生地提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞都有一定的抑制作用，且抑制率隨藥物濃度的增加而增加。水牛角提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞具有一定促進(jìn)生長(zhǎng)作用，且在一定濃度范圍內(nèi)，隨藥物濃度增加，促進(jìn)生長(zhǎng)作用加強(qiáng)。見表1～5，圖1～7。

表5 生地提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖的影響

圖1 空白對(duì)照組細(xì)胞邊境清楚，長(zhǎng)勢(shì)良好

圖2 8mg/mL大青葉提取物作用24h后，大部分細(xì)胞仍保持正常的細(xì)胞形態(tài)，少量細(xì)胞明顯變圓，呈空泡狀。

圖3 40mg/m L大青葉提取物作用24h后，大量細(xì)胞明顯變圓，呈空泡狀，貼壁不牢，或漂浮。

圖4 40mg/mL龍膽草提取物作用24h后，大量細(xì)胞明顯變圓，呈空泡狀，貼壁不牢，或漂浮。

圖5 90mg/mL水牛角提取物作用24h后，細(xì)胞邊境清楚，長(zhǎng)勢(shì)良好，較空白對(duì)照組細(xì)胞更密集。

圖6 90mg/mL黃芩提取物作用24h后，細(xì)胞邊界模糊，貼壁不牢。

圖7 90mg/mL生地提取物作用24h，部分細(xì)胞邊界模糊。

3 討論

銀屑病中醫(yī)稱之為白疕，其進(jìn)展期臨床多為里熱熾盛，臨床上常用清熱類中藥對(duì)癥治療，療效確切。馬麗俐等[5]用清熱涼血方治療血熱型銀屑病31例，治療后患者的PASI指數(shù)較治療前明顯降低（P＜0.01）?！鞍庄H一號(hào)”、“消銀解毒湯”、“克銀一號(hào)”等諸多方劑均用到大青葉、水牛角、龍膽草、生地、黃芩等中藥[6-8]。本實(shí)驗(yàn)選取的單味清熱類中藥均為里熱證銀屑病常用藥物。

中藥提取物作用于細(xì)胞已經(jīng)是一種很普遍的實(shí)驗(yàn)方法[9-10]。研究表明，銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯高于健康人[11]，而EGF及其受體在銀屑病的表皮過度增殖中起著關(guān)鍵作用，是引起該病重要的致病因子之一[12]。本實(shí)驗(yàn)用rhEGF刺激Ha?CaT細(xì)胞使其處于過度增殖狀態(tài)，模擬銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖的情況[13]。并通過MTT方法觀察5種清熱類中藥對(duì)HaCaT細(xì)胞活性的影響。結(jié)果顯示，大青葉、龍膽草、黃芩、生地黃提取物對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖都有一定的抑制作用。說明大青葉、龍膽草、黃芩、生地能抑制HaCaT細(xì)胞的增殖，其作用強(qiáng)度與藥物濃度和作用時(shí)間有關(guān)。抑制角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖可能是大青葉、龍膽草、黃芩、生地治療銀屑病的作用機(jī)制之一。但是水牛角對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖無抑制作用，表明水牛角治療銀屑病的作用機(jī)制可能與大青葉、龍膽草等不同。抗炎、降低毛細(xì)血管通透性可能為水牛角治療銀屑病的作用機(jī)制之一[14-17]。

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Effect of Chinese Herbs w ith Properties of Clearing away Heat on the Proliferation of HaCaT Cells

ZHENG Ming-jing,MA Li-li.The First College of Clinical Medicine,Zhejiang Traditional Chinese Medicine Uni?versity,Hangzhou(310053),China

Objective:To investigate the influence of folium,buffalo horn,gentian,habitat,and skullcap extracts on the proliferation of HaCaT cells.M ethods:The 24h inhibitory rate of HaCaT cell proliferation by the above mentioned Chinese herbs was examined by the MTT method.Results:Folium,gentian,skullcap,and habitat ex?tracts inhibited the proliferation of HaCaT cells in a dose-dependent manner,while buffalo horn extract advanced the proliferation of the cells in a dose-dependent manner,and these results were all significantly different as compared to blank control groups(P＜0.05).Conclusion:One of the mechanisms by which folium,buffalo horn, gentian,and skullcap treat psoriasis may be inhibiting the proliferation of malpighian cells,while buffalo horn does not have the same effect when being used to treat psoriasis.

psoriasis HaCaT cells Chinese herbs with properties of clearing away heat

2012-11-05

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No.Y2091225）

馬麗俐，Tel:13858022185，E-mail:Ma-lil@ihotmai.l.com