石占利 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 杭州 310003

陳芝蕓 高 凱 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院

不同pH值L-精氨酸誘導(dǎo)小鼠急性胰腺炎模型效果觀察

石占利 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 杭州 310003

陳芝蕓 高 凱 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一臨床醫(yī)學(xué)院

目的：觀察不同pH值L-精氨酸腹腔注射誘導(dǎo)急性胰腺炎模型的效果。方法：70只BABL/ C小鼠，隨機(jī)分為pH11組、pH8組和對(duì)照組，分別采用pH值為11的20%L-精氨酸溶液、pH值為8的20%L-精氨酸溶液、等體積生理鹽水，間隔1h 2次小鼠腹腔內(nèi)注射（250mg/100g體質(zhì)量）的方法。在24h和48h分別觀測三組小鼠的血清淀粉酶、胰腺病理學(xué)評(píng)分，并統(tǒng)計(jì)死亡率。結(jié)果：pH11組、pH8組小鼠在24h和48h的血清淀粉酶水平均較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；PH11組較pH8組24h和48h血清淀粉酶水平均升高更明顯（P＜0.01）；pH8組24h和48h胰腺病理評(píng)分均較pH11組顯著降低（P＜0.05），同時(shí)該組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的小鼠死亡率也較后者顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：L-精氨酸溶液的pH值對(duì)胰腺損傷程度和動(dòng)物的死亡率產(chǎn)生很大影響；精氨酸的強(qiáng)堿性對(duì)腹腔臟器的損傷是導(dǎo)致模型病變不穩(wěn)定性的重要原因。

急性胰腺炎 小鼠 L-精氨酸

急性胰腺炎是臨床常見的危重病，病情進(jìn)展快，病死率高，動(dòng)物模型是研究其病機(jī)、轉(zhuǎn)歸以及臨床療效的重要途徑。多年來，應(yīng)用精氨酸腹腔注射已經(jīng)成為急性胰腺炎重要的造模方法，但國內(nèi)外對(duì)精氨酸的應(yīng)用劑量和造模效果存在著較大爭議，筆者通過較系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)對(duì)該方法進(jìn)行研究，進(jìn)一步探討該研究方法的干擾因素，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BABL/C小鼠，雄性，體質(zhì)量（20.82± 0.93）g，SPF級(jí)，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：2008001619613。

1.2 試 劑 L-精氨酸（L-Arg）純度≥98%，購自Sigma公司（貨號(hào)A5006）應(yīng)用生理鹽水配制濃度為20%的L-精氨酸溶液；應(yīng)用pH試紙測定配制溶液的pH值。

1.3 分組及實(shí)驗(yàn)方法 70只小鼠隨機(jī)分為三組：pH11組30只：應(yīng)用20%L-精氨酸溶液，pH值為11，按照250mg/100g體質(zhì)量/次，間隔1h，共2次腹腔注射；pH8組20只：先將配制的20%L-精氨酸溶液應(yīng)用鹽酸調(diào)整pH為8，然后按照250mg/100g體質(zhì)量/次，間隔1h，共兩次腹腔注射；對(duì)照組20只：采用與pH8組相同體積的生理鹽水，間隔1h，共2次腹腔注射。每組均觀察24、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)；其中pH11組在各時(shí)間點(diǎn)分別隨機(jī)入選15只小鼠；其余組別各時(shí)間點(diǎn)均隨機(jī)選入10只小鼠。

實(shí)驗(yàn)前各組小鼠禁食12h，不禁水；造模后各組均不禁水、禁食。

1.4 標(biāo)本留置方法 在24、48h分別經(jīng)摘除眼球取血并處死，留取胰腺組織。所采全血立即經(jīng)低溫自動(dòng)平衡離心機(jī)離心（4 000rpm）10min，分離血清，-20℃保存；胰腺組織浸于10%甲醛溶液中固定24h，經(jīng)過脫水、透明，石蠟包埋后制成石蠟切片并HE染色，請病理專業(yè)人員進(jìn)行胰腺炎組織病理評(píng)價(jià)。

1.5 檢測指標(biāo) 24、48h小鼠的死亡率；血清淀粉酶；胰腺病理切片，每張切片觀察10個(gè)視野，采用Schmidt J[1]等評(píng)分方法對(duì)胰腺病理進(jìn)行評(píng)分，見表1。

表1 急性胰腺炎胰腺局部病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)量資料采用方差分析、t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠血清淀粉酶變化 經(jīng)過不同pH值L-精氨酸溶液腹腔注射后，小鼠24、48h的血清淀粉酶水平較對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；24、48h時(shí)pH11組血清淀粉酶水平均較pH8組顯著增高（P＜0.01）；pH8組48h的血清淀粉酶水平較24h顯著增高（P＜0.01），而pH11組48h的血清淀粉酶水平與24h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 三組血清淀粉酶水平比較（±s）U/L

表2 三組血清淀粉酶水平比較（±s）U/L

注：與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與同時(shí)間點(diǎn)pH11組比較，▲▲P＜0.01；與同組24h比較，*P＜0.01

組別pH8組pH11組對(duì)照組n/只n/只971 0 24h 785.60±206.80△▲▲2667.33±843.76△△525.10±174.84 851 0 48h 1161.75±221.65△△▲▲* 2344.83±537.07△△517.60±113.35

2.2 胰腺組織病理變化

2.2.1 大體觀察 對(duì)照組胰腺無明顯病理改變；pH8組小鼠24、48h均未見腹水，也未見明顯出血水腫，但可見胰腺充血，色澤變紅；pH11組小鼠24h可見胰腺充血水腫，未見壞死病灶，腹腔輕微腹水，48h可見腹水量增多，胰腺水腫較前明顯，腸系膜輕度水腫。

2.2.2 鏡下觀察 對(duì)照組24、48h均未見明顯病變，胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，無明顯出血壞死和水腫等異常表現(xiàn)（見圖1，2）；pH8組24h可見小葉間區(qū)域性水腫，48h時(shí)水腫較前明顯，伴少量炎細(xì)胞浸潤，但胰腺小葉結(jié)構(gòu)完好，腺泡細(xì)胞無出血壞死等表現(xiàn)（見圖3，4）；pH11組24h可見小葉內(nèi)明顯充血水腫，小葉間少量炎性細(xì)胞浸潤，而48h則水腫進(jìn)一步明顯，出現(xiàn)少量腺泡細(xì)胞壞死，細(xì)胞核固縮，但未見出血性病變（見圖5，6）。

2.2.3 病理評(píng)分 pH8組和PH11組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)胰腺病理評(píng)分均較對(duì)照組（評(píng)分為0）顯著升高（P＜0.05）；pH8和pH11組本組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)評(píng)分比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.350，P=0.687），而在24、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，pH11組病理評(píng)分均較PH8組顯著增高（P值分別為0.025和0.048），見表3。

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理評(píng)分比較（±s） 分

表3 兩組不同時(shí)間點(diǎn)胰腺組織病理評(píng)分比較（±s） 分

注：與pH11組比較，▲P＜0.05

組別pH8組pH11組24h 1.11±0.60▲2.00±0.82 48h 1.38±0.52▲2.20±0.84

2.2.4 小鼠死亡率比較 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)均無小鼠死亡；pH11組24、48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的小鼠死亡率均顯著高于pH8組（P＜0.05）；pH8組、pH11組24、48h本組兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)死亡率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.659）；見表4。

圖1 對(duì)照組24h HE×200

圖2 對(duì)照組48h HE×200

圖3 pH8組24h HE×200

圖4 pH8組48h HE×200

圖5 pH11組24h HE×200

圖6 pH11組48h HE×200

表4 兩組不同時(shí)間點(diǎn)死亡率比較 只

3 討 論

Mizinuma等[2]于1984年首次通過在大鼠腹腔內(nèi)注射大劑量L-精氨酸（500mg/100g）創(chuàng)立了一種新的胰腺炎造模方法，此后這種方法被廣泛的應(yīng)用于急性胰腺炎病理過程的相關(guān)研究。但是該方法的造模效果同時(shí)受到藥物濃度、用藥劑量和用藥間隔時(shí)間等諸多因素干擾，導(dǎo)致模型出現(xiàn)不穩(wěn)定性，所以目前對(duì)該方法的具體操作仍存在較大爭議。Tani等[3]研究發(fā)現(xiàn)單次腹腔注射大劑量L-精氨酸（500mg/100g）的大鼠在72h內(nèi)可以導(dǎo)致70%～80%的胰腺組織出現(xiàn)壞死，但是大鼠在幾小時(shí)內(nèi)幾乎全部死亡，所以注射方法之后也在不斷改進(jìn)。

目前對(duì)急性胰腺炎病機(jī)研究方面多項(xiàng)報(bào)道[4-5]采用了兩次注射法，每次注射250mg/100g體質(zhì)量，間隔1h。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，20%L-精氨酸未經(jīng)pH調(diào)整，按照300mg/100g體質(zhì)量和350mg/100g體質(zhì)量進(jìn)行腹腔注射后，BaBL/C小鼠24h死亡率在90%左右；而經(jīng)過對(duì)L-精氨酸pH調(diào)整后，小鼠死亡率明顯下降，并伴隨胰腺損傷的減輕。為進(jìn)一步探究試劑pH值對(duì)模型的影響，本次選擇了250mg/100g體質(zhì)量的L-精氨酸注射劑量進(jìn)行研究。

關(guān)于L-精氨酸導(dǎo)致急性胰腺炎的病理機(jī)制目前尚不明確，目前研究主要涉及氧自由基、NO、NF-κB及炎癥介質(zhì)等引起的胰腺損傷[6-7]。但是，左旋精氨酸溶液PH值的影響不可忽視。我們經(jīng)過配制后發(fā)現(xiàn)其溶液呈現(xiàn)強(qiáng)堿性，所以一些研究者為排除強(qiáng)堿引起的腹腔臟器損傷，包括胰腺損傷，在實(shí)驗(yàn)中調(diào)整了pH值，結(jié)果得出了不同的結(jié)論。Rajinder Dawra等[8]應(yīng)用pH為7的8%L-精氨酸（鹽酸矯正pH值）對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行了多次研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用2次注射法時(shí)只有注射劑量達(dá)到4g/kg×2時(shí)才能導(dǎo)致胰腺明顯損傷，而小于該劑量（1、2或3g/kg體質(zhì)量）時(shí)胰腺病理改變、血清淀粉酶及胰腺M(fèi)PO活性和對(duì)照組（生理鹽水）并無顯著差異，這與本研究結(jié)果具有一致性，同時(shí)提示矯正pH值后造模所需L-精氨酸劑量明顯增加。但是該研究使用的L-精氨酸濃度為8%，每10g體質(zhì)量需要腹腔注射0.5mL，注射劑量較大，小鼠有可能出現(xiàn)容量負(fù)荷過重而死亡，遺憾的是該研究并未提及小鼠的死亡率；故此本研究采用了20%的L-精氨酸，并應(yīng)用不同pH值進(jìn)行進(jìn)一步隨機(jī)對(duì)照研究。

本研究證實(shí)，經(jīng)過L-精氨酸pH調(diào)整后，胰腺僅出現(xiàn)極輕度的水腫和少量炎細(xì)胞浸潤，模型的血清淀粉酶水平和病理評(píng)分均顯著下降，同時(shí)死亡率也顯著下降。pH11時(shí)小鼠24h死亡率53%（8/15），48h其死亡率達(dá)到了67%（10/15），而pH8時(shí)僅在10%～20%。由此再次證實(shí)L-精氨酸PH值是造成胰腺損傷的重要因素，也是導(dǎo)致模型不穩(wěn)定性的重要原因。必須指出的是，L-精氨酸為pH8時(shí)，胰腺病理僅出現(xiàn)輕度的水腫，pH11時(shí)出現(xiàn)較明顯水腫，但是均無出血及壞死等重癥胰腺炎表現(xiàn)。此外，動(dòng)物品系也是影響模型病理表現(xiàn)及死亡率的重要因素。有學(xué)者[9]應(yīng)用雨蛙素對(duì)昆明白、ICR及BABL/C三種品系小鼠進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)BABL/C小鼠更適用于急性胰腺炎模型的研究，其死亡率也相對(duì)較高。另有研究[10]采用腹腔注射L-精氨酸方法對(duì)C57BL/6和BABL/C兩種品系小鼠進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩種品系急性胰腺炎時(shí)組織炎癥因子表達(dá)存在顯著差異，相同注射劑量下BABL/C炎癥反應(yīng)更重；C57BL/6模型小鼠24h死亡率為10%（2/20），顯著低于BABL/C模型小鼠24h死亡率（40%，8/20，P＜0.05）。

綜上所述，精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎模型時(shí)，試劑pH值對(duì)胰腺損傷程度和動(dòng)物的死亡率產(chǎn)生很大影響；精氨酸的強(qiáng)堿性對(duì)腹腔臟器的損傷是導(dǎo)致模型病變不穩(wěn)定性的重要原因。所以我們認(rèn)為，精氨酸誘導(dǎo)急性胰腺炎時(shí)必須校正pH值，借以排除強(qiáng)堿對(duì)腹腔臟器甚至腹腔外臟器導(dǎo)致的化學(xué)性損傷，同時(shí)加大精氨酸注射劑量，這樣誘導(dǎo)出的模型才更符合急性胰腺炎的病理過程，尤其在研究急性胰腺炎繼發(fā)其他臟器損傷過程時(shí)。

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Ef f e c t o f Ac u t e Pa n c r ea t i t i s Mo d e l In d u c e d b y Di f f e r en t p HVa l ue s o f L-a r g i n i ne

SHIZhan-li,CHENZhi-yun,GAOkai.The Affiliated Integrated Chinese and Western Medicine Hospital of Zhejiang Traditiona lChi?nese Medicine University,Hangzhou(310003),China

Objective:To investigate the effect of acute pancreatitis model induced by different pH values of L-arginine.Methods:Seventy BABL/C mice were randomly divided into 3 groups.Two groups were treated with L-arginine solution of pH 11 and pH 8,respectively.L-arginine solutions were intraperitoneally injected 250mg/ 100g body weight twice at an interval of 1 hour.Another group served as control and was treated with same vol?ume of saline.Serum amylase was determined and pancreas pathological score and mortality rate were calculated in all groups at the time of 24 and 48 hours after injection.Results:Compared with the control group,the se?rum amylase levels were significantly increased in the pH11 group and pH8 group at the time of 24 and 48 hours(P＜0.01).Compared with the pH11 group,the serum amylase levels in the pH8 group were significantly de?creased at the time of 24h and 48h(P＜0.01),meanwhile,the pancreas pathological score and mortality rate in the pH8 group were also decreased significantly at both time points(P＜0.05).Conclusion:The pH value of L-ar?ginine solution has a significant impact on the degree of pancreatic injury and animal mortality.The strong alka?line of L-arginine which does damage to abdominal organs is an important reason for instability of acute pancre?as model.

acute pancreatitis mice L-arginine

2012-10-22

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2011KYB075）