陽(yáng)剛　白璐　李正文

摘要：提取分離大青葉并測(cè)定各級(jí)提取物對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的抑菌活性。采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC）以追蹤大青葉的活性部位及其活性成分。采用80%的乙醇提取并通過(guò)硅膠柱色譜法對(duì)其進(jìn)一步分離，測(cè)定抑菌活性，追蹤其活性段。同時(shí)以石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、水依次提取，測(cè)定抑菌活性，并對(duì)提取物的化學(xué)成分進(jìn)行初步分析。硅膠柱色譜各分離組分對(duì)試驗(yàn)菌均有不同程度的抑制作用，抑菌效果最好的為組分3，其MIC為3.91 mg/mL。各級(jí)提取物中抑菌活性較好的為乙酸乙酯提取物，其MIC為3.91 mg/mL。其抑制胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌生長(zhǎng)的主要成分可能為生物堿、有機(jī)酸和黃酮類(lèi)物質(zhì)。

關(guān)鍵詞：大青葉；硅膠柱色譜；系統(tǒng)溶劑提??；抑菌活性；成分分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2018）10-0007-04

大青葉是十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigotica Fort.）的干燥葉，具有清熱、解毒、涼血、止血等功效，用于治療熱毒發(fā)斑、丹毒、咽喉腫痛、口舌生瘡、瘡癰腫毒等癥?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有廣泛的抗菌作用，對(duì)革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌具有較好的效果[1-3]。目前關(guān)于大青葉抑菌活性的報(bào)道集中在其各級(jí)提取物，缺少對(duì)其抑菌成分的進(jìn)一步研究[4]。本試驗(yàn)通過(guò)不同提取分離方法，以豬胸膜放線(xiàn)桿菌為試驗(yàn)菌，采用二倍稀釋法測(cè)定最小抑菌濃度（Minimal inhibitoryconcentration，MIC）和最小殺菌濃度（Minimal bactericidal concentration，MBC），追蹤其抑菌的活性部位或活性成分，為進(jìn)一步分離大青葉中抗胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌活性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大青葉（產(chǎn)地河北）購(gòu)置于四川雅安惠民堂藥業(yè)連鎖有限責(zé)任公司。豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)獸藥監(jiān)察所，編號(hào)為ATCC 265。

1.2 主要試劑及儀器

氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亞砜等有機(jī)試劑，均為分析純，購(gòu)于成都市科龍化工試劑廠。茚三酮、碘化鉍鉀、硅鎢酸、三氯化鐵、三氯化鋁、濃硫酸、濃鹽酸、溴甲酚綠、醋酸鎂、鹽酸羥胺、4-氨基安替比林、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、明膠、氫氧化鈉、氫氧化鉀等分析試劑。電熱套，電子天平，滅菌鍋，索氏提取器，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等。

1.3 培養(yǎng)基

含0.02% NAD的TSB和含0.02% NAD的TSA。

1.4 方法

1.4.1 大青葉80%乙醇提取 準(zhǔn)確稱(chēng)定100 g大青葉粉末，80%乙醇，60 ℃索氏回流提取，料液比1∶10，每次8 h，共3次，抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無(wú)乙醇味，25 ℃下避光干燥至浸膏狀備用，并計(jì)算提取率。

（1）大青葉薄層條件的篩選。經(jīng)過(guò)篩選，甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）有較好的分離效果。

（2）大青葉的硅膠色譜分離。100～200目硅膠共600 g，5 g浸膏以200～300目硅膠拌樣，真空干燥，干法上樣，以甲苯-氯仿-丙酮（5∶5∶4）梯度洗脫，每25 mL收集一次。根據(jù)TCL檢測(cè)合并相同組分，得到5個(gè)組分。

1.4.2 系統(tǒng)溶劑法提取 準(zhǔn)確稱(chēng)量100 g大青葉粉末，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇和水，4 ℃提取，每次8 h，相同溶劑每次重復(fù)3次，合并相同組分；合并后的萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至無(wú)有機(jī)溶劑味，25 ℃下避光干燥至浸膏狀備用，并計(jì)算提取率。

1.4.3 抑菌效果的測(cè)定

（1）菌懸液的制備。將胸膜放線(xiàn)桿菌接種到含0.02%的TSA培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)好后挑選單個(gè)菌落，接種于無(wú)菌試管中，涂板計(jì)數(shù)，以無(wú)菌蒸餾水稀釋至106 CFU/mL備用。

（2）最小抑菌濃度的測(cè)定。將各提取部分以二甲亞砜溶解，配置成一定濃度的溶液。96孔板，無(wú)菌操作，首先在每排1～10孔內(nèi)分別依次加入含0.02% NAD的TSB液體100 μL，然后再每排第一孔再加入100 μL藥液，混合均勻后取100 μL到第2孔，依次混合稀釋直至第10孔。完成上述操作后，取制備好的細(xì)菌，向每孔加入100 μL菌液（106 CFU/mL），使菌液濃度最終為5×105 CFU/mL。第11孔為陰性對(duì)照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL藥液），12孔為陽(yáng)性對(duì)照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL菌液），另取一孔作為空白對(duì)照（100 μL含0.02%NAD的TSB和100 μL二甲亞砜），各組分平行3次?；靹?，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。在陽(yáng)性對(duì)照組溶液渾濁，陰性對(duì)照組溶液澄清的情況下，且在二甲亞砜沒(méi)有抑制胸膜放線(xiàn)桿菌生長(zhǎng)的濃度下，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組眼觀溶液澄清、顏色未發(fā)生變化的最低藥物濃度則作為該藥的MIC。

（3）最小殺菌濃度的測(cè)定。試驗(yàn)組澄清的各孔中液體接種涂布于TSA固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。平皿培養(yǎng)基中計(jì)數(shù)少于5個(gè)菌落，該藥物濃度值為其MBC值[5]。

1.4.4 各級(jí)提取物成分的初步分析 將各級(jí)提取物按照天然藥物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)方法，對(duì)其成分進(jìn)行初步分析[6，7]?；衔锒ㄐ澡b定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 80%乙醇提取物體外抑菌效果

大青葉80%乙醇提取物及其硅膠色譜各分離組分的體外抑菌效果見(jiàn)表2。由表2可知，各分離產(chǎn)物對(duì)豬胸膜放線(xiàn)桿菌均有較好的抑制作用，其分離產(chǎn)物中的3和4兩個(gè)組分有很強(qiáng)的抑菌效果，其MIC分別為3.91、7.82 mg/mL，其MBC值分別為7.82、15.63 mg/mL。其次分離組分1、組分2、組分5的MIC值均為31.25 mg/mL。

2.2 系統(tǒng)溶劑提取法提取物的體外抑菌效果

大青葉系統(tǒng)溶劑提取法提取產(chǎn)物的體外抑菌效果見(jiàn)表3。由表3可知，各組分對(duì)豬胸膜放線(xiàn)桿菌均有較強(qiáng)的抑制效果。其中以乙酸乙酯提取物的抑菌能力最好，其MIC為3.91 mg/mL，MBC也較其他組分低，為7.82 mg/mL，其次為丙酮提取物，其MIC為7.82 mg/mL。氯仿提取物MIC為15.63 mg/mL，石油醚和甲醇提取物抑菌效果較差，為31.25 mg/mL。大青葉的水提物的MIC為62.50 mg/mL。

2.3 大青葉系統(tǒng)溶劑提取的各級(jí)提取物定性試驗(yàn)結(jié)果

為了初步判斷抑菌活性部位的成分，對(duì)其成分進(jìn)行了初步定性分析。大青葉系統(tǒng)溶劑法各級(jí)提取物的定性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可初步判斷，石油醚提取物中主要含有油脂和甾體成分。氯仿提取物中主要存在黃酮類(lèi)、有機(jī)酸、油脂。乙酸乙酯和丙酮提取物中主要存在生物堿、黃酮類(lèi)和有機(jī)酸。甲醇和水提取物中含有氨基酸、糖類(lèi)及黃酮類(lèi)物質(zhì)。水提取物還含有皂苷。

3 討論

豬胸膜放線(xiàn)桿菌主要引起以急性胸膜肺炎為特征的呼吸道傳染性疾病，是臨床上的常見(jiàn)疾病，給養(yǎng)殖業(yè)造成的危害巨大[6，7]。臨床多用青霉素、四環(huán)素、磺胺類(lèi)藥物治療。唐萬(wàn)勇等[8]研究氟苯尼考、多西環(huán)素、TMP和黏桿菌素對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抑菌效果，結(jié)果表明抑菌效果顯著。但長(zhǎng)期使用抗生素不僅會(huì)造成細(xì)菌耐藥性增加也會(huì)使抗生素在動(dòng)物體內(nèi)殘留，進(jìn)而威脅人類(lèi)健康[9，10]。我國(guó)中藥資源豐富，從傳統(tǒng)中藥材中找到抗生素的代替品，避免細(xì)菌對(duì)抗生素的長(zhǎng)期耐藥，緩解抗生素短缺是目前研究的熱點(diǎn)[11，12]。劉仁志等[13]研究表明大蒜揮發(fā)油和廣藿香揮發(fā)油的復(fù)方制劑對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度分別為3.9 mg/mL和7.8 mg/mL。康帥等[14]通過(guò)對(duì)烏梅等20種中藥對(duì)豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌的體外抑菌活性試驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)大青葉80%乙醇提取物對(duì)胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌有較好抑制效果。大青葉作為傳統(tǒng)純天然藥物，其毒性低、副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均有較為明顯的效果，是藥物開(kāi)發(fā)的理想對(duì)象[15]。本試驗(yàn)對(duì)大青葉80%乙醇索氏回流提取物進(jìn)行層析分離，進(jìn)一步追蹤其活性部位。硅膠柱色譜法的分離原理是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，一般情況下極性較大的物質(zhì)易被硅膠吸附，極性較弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附，首先洗脫下來(lái)的是極性較小的組分。通過(guò)層析分離，在得到的組分中，抑菌活性較好的部分為3、4兩個(gè)組分，其MIC分別為3.91 mg/mL和7.82 mg/mL。然而，硅膠柱色譜法進(jìn)行分離由于溫度、上樣量、流速和其他人為因素的影響，不利于進(jìn)一步的分離工作[16]。因此改用系統(tǒng)溶劑提取法對(duì)其抑菌活性部位進(jìn)行追蹤并對(duì)其成分進(jìn)行初步的定性分析。試驗(yàn)表明石油醚提取物抑菌性能相對(duì)不強(qiáng)，而大青葉的各級(jí)提取物中乙酸乙酯提取物對(duì)豬胸膜放線(xiàn)桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，為3.91 mg/mL。丙酮提取物也有很好的效果，其MIC為7.82 mg/mL。說(shuō)明大青葉中的抗菌有效成分主要在乙酸乙酯等中大極性的溶液當(dāng)中。這可能與乙酸乙酯與丙酮極性較為相近，其提取的產(chǎn)物相近有關(guān)。通過(guò)初步定性分析，其抗菌有效成分可能為生物堿和黃酮類(lèi)成分。生物堿及黃酮類(lèi)化合物資源豐富，抗菌譜廣，對(duì)包括耐藥菌在內(nèi)的菌株具有良好的抗菌效果[17，18]。劉軍鋒等[19]采用抑菌圈法測(cè)定了苦參堿等5種生物堿對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抗菌活性，結(jié)果表明5種生物堿對(duì)3種細(xì)菌生長(zhǎng)均具有顯著的抑制作用?；磴y強(qiáng)等[20]發(fā)現(xiàn)銀杏葉黃酮對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌有明顯的抗菌作用。研究表明，生物堿及黃酮類(lèi)化合物抗菌作用機(jī)制可能與菌體細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的破壞及膜通透性的改變、相關(guān)酶和外排泵的抑制、影響菌體DNA和相關(guān)蛋白合成等多個(gè)方面有關(guān)[21，22]。大青葉對(duì)豬胸膜肺炎防線(xiàn)桿菌的抗菌機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 小結(jié)

試驗(yàn)對(duì)大青葉的各級(jí)提取物對(duì)豬胸膜放線(xiàn)桿菌體外抑菌活性進(jìn)行研究，證明了大青葉對(duì)豬胸膜放線(xiàn)桿菌有較高抑菌活性的部位在乙酸乙酯和丙酮提取部位，通過(guò)初步定性分析，其抗菌有效成分可能為生物堿和黃酮類(lèi)成分，為進(jìn)一步分離大青葉抗胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌奠定了基礎(chǔ)。

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