高婷　袁芳艷　劉澤文

摘要：從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場具有嚴重呼吸道癥狀的疑似病例中，通過臨床解剖采集豬的腦組織、肺組織、扁桃體組織、關(guān)節(jié)液等病料進行細菌的分離培養(yǎng)、革蘭氏染色、菌落形態(tài)觀察、PCR鑒定及藥敏試驗。結(jié)果表明，分離到的一株細菌為豬鏈球菌，經(jīng)PCR分型鑒定結(jié)果為2型豬鏈球菌，藥敏試驗顯示，該菌對阿莫西林、氨芐西林高度敏感，為豬場用藥提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬鏈球菌；分離；鑒定；耐藥性

中圖分類號：S858.28 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2018）10-0005-02

豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）是一種重要的人獸共患傳染病的病原菌，其不僅可以感染豬導致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及心內(nèi)膜炎等，引起斷奶仔豬或育肥豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，還可以感染人導致敗血癥型休克甚至死亡，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全[1，2]。本研究對湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場采集了疑似病豬的腦、肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液等病料，進行了細菌分離培養(yǎng)及鑒定，通過分型及藥敏試驗，初步了解了該豬場鏈球菌病發(fā)病情況，篩選出了高敏感藥物，為豬場臨床用藥選擇以及接種與血清型相符的疫苗進行預(yù)防提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料采集

從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場采集發(fā)病豬的腦、肺臟、扁桃體、關(guān)節(jié)液等病料。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）購自Difco公司；革蘭氏染色液購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；無菌脫纖綿羊血均購自南京茂捷微生物科技有限公司；藥敏紙片購自北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司；2×Taq mix、2 000 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 培養(yǎng)基的配置

TSA固體培養(yǎng)基：取TSA培養(yǎng)基粉末4 g，溶于100 mL超純水中，115 ℃滅菌15 min，冷卻至50 ℃加新生牛血清10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存?zhèn)溆?。血平皿：TSA固體培養(yǎng)基滅菌后冷卻至50 ℃加無菌脫纖綿羊血10 mL，傾倒平皿，4 ℃保存?zhèn)溆肹3]。

1.4 細菌分離鑒定

1.4.1 細菌的分離培養(yǎng) 無菌采取豬病料均勻涂布于血平皿培養(yǎng)基上，37 ℃溫箱中培養(yǎng)12 h后，挑選可疑單個鏈球菌菌落純化，37 ℃培養(yǎng)12 h，觀察細菌的生長情況。

1.4.2 鏡檢 挑取TSA平板上的單菌落，革蘭氏染色后用光學顯微鏡觀察細菌的顏色和形態(tài)[4]。

1.4.3 生化鑒定 挑取TSA平板上的單菌落，搖菌培養(yǎng)至對數(shù)期，將菌液接種乳糖、甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖和麥芽糖等生化鑒定管，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.4.4 PCR分型 參照文獻設(shè)計豬鏈球菌與豬鏈球菌2型特異性引物[5，6]，用于豬鏈球菌的鑒定和分型，引物序列見表1。挑取疑似SS并純化的單菌落裂解，作為PCR擴增的模板，空白對照用等體積的去離子水代替模板，陽性對照為實驗室保存的2型豬鏈球菌。

1.5 藥敏試驗

將分離純化的菌株按常規(guī)方法進行藥敏試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的形態(tài)特征

分離到的細菌在加血清的TSA上菌落呈半透明、光滑、圓形突起的細小菌落，順著光線看去菌落泛著藍光。在血平板上可見生長均一的細菌，菌落周圍有α溶血環(huán)。革蘭氏染色為革蘭氏陽性菌，卵圓形，鏈狀，鏈的長短由2～5個球菌組成。

2.2 生化鑒定結(jié)果

生化鑒定結(jié)果顯示，分離的疑似菌脲酶試驗、氧化酶試驗、吲哚試驗、M-R 試驗、V-P試驗、觸酶試驗均為陰性；發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖、棉實糖、七葉苷、水楊苷等碳水化合物；不發(fā)酵木糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、菊糖；符合豬鏈球菌的生化特征。

2.3 PCR擴增結(jié)果

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，用豬鏈球菌特異性基因16srRNA的引物能擴出目的條帶，標準豬鏈球菌和分離株均在1 066 bp處（圖2）；用2型豬鏈球菌特異性基因cps2J的引物能擴出目的條帶，標準豬鏈球菌和分離株均在557 bp處（圖2），與預(yù)期片段一致，測序與豬鏈球菌SC19序列一致，證明所分離菌株為2型豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗結(jié)果

對分離的2型豬鏈球菌進行了14種抗菌藥物的耐藥性試驗，結(jié)果顯示，分離菌株對強力霉素、卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟等產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感（表2），臨床上可用該藥對發(fā)病豬進行治療。

3 討論

根據(jù)莢膜多糖的差異，豬鏈球菌可分為33個血清型[7，8]，其中2型是毒力最強的優(yōu)勢血清型[2，5，7，9，10]，其不僅可以感染豬導致敗血癥、肺炎、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及心內(nèi)膜炎等，引起斷奶仔豬或者育肥豬死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟損失，還可以感染人導致敗血癥型休克甚至死亡，嚴重威脅著人類的身體健康和生命安全[1]。本研究從湖北省武漢市江夏區(qū)某豬場分離出一株細菌，經(jīng)革蘭氏染色確定為革蘭氏陽性菌，隨后采用生化鑒定方法和PCR技術(shù)，證實該菌為2型豬鏈球菌。藥敏試驗結(jié)果顯示，2型豬鏈菌對強力霉素、卡那霉素、四環(huán)素、林可霉素、頭孢曲松、阿米卡星、慶大霉素、頭孢噻肟產(chǎn)生耐藥性，對環(huán)丙沙星、阿莫西林和氨芐西林藥物高度敏感。臨床上，建議采用藥敏試驗篩選出高敏感藥物進行治療，可很大程度上改善病情，并建議在生產(chǎn)實踐中注射含有2型豬鏈球菌的多價疫苗，以期更好地預(yù)防豬鏈球菌病的發(fā)生和流行。

參考文獻：

[1] GAO T，TAN M，LIU W，et al. GidA，a tRNA modification enzyme，contributes to the growth，and virulence of Streptococcus suis serotype 2 [J].Front Cell Infect Microbiol，2016，6：44.

[2] SEGURA M，F(xiàn)ITTIPALDI N，CALZAS C，et al. Critical Streptococcus suis virulence factors：Are they all really critical[J].Trends Microbiol，2017，25（7）：585-599.

[3] TAN M F，LIU W Q，ZHANG C Y，et al. The involvement of MsmK in pathogenesis of the Streptococcus suis serotype 2[J].Microbiologyopen，2017，6（2）：e00433.

[4] ZHANG C，SUN W，TAN M，et al. The eukaryote-like serine/threonine kinase STK regulates the growth and metabolism of zoonotic Streptococcus suis[J].Frontiers in Cellular and Infection Microbiology，2017，7：66

[5] MAROIS C，BOUGEARD S，GOTTSCHALK M，et al. Multiplex PCR assay for detection of Streptococcus suis species and serotypes 2 and 1/2 in tonsils of live and dead pigs[J].J Clin Microbiol，2004，42（7）：3169-3175.

[6] SMITH H，VEENBERGEN V，VANDER J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9 development of rapid serotype-specific PCR assays[J].Journal of clinical microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7] GOYETTE-DESJARDINS G，AUGER J P，XU J，et al. Streptococcus suis，an important pig pathogen and emerging zoonotic agent—an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing[J].Emerging Microbes & Infections，2014，3（6）：e45.

[8] LUN Z R，WANG Q P，CHEN X G，et al. Streptococcus suis：an emerging zoonotic pathogen[J].The Lancet Infectious Diseases，2007，7（3）：201-209.

[9] FENG Y，ZHANG H，WU Z，et al. Streptococcus suis infection：an emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases[J].Virulence，2014，5（4）：477-497.

[10] TANG J，WANG C，F(xiàn)ENG Y，et al. Streptococcal Toxic Shock Syndrome Caused by Streptococcus suis Serotype 2[J].PLoS Medicine，2006，3（5）：e151.