韋海鵬 鐘永軍 李曉華

1.北海市人民醫(yī)院皮膚科,廣西北海 536000;2.右江民族醫(yī)學(xué)院微免教研室,廣西百色 533000

臨床上,白癜風(fēng)是一種以局部色素脫失形成白斑為特征的常見(jiàn)多發(fā)性色素性皮膚病,是一種獲得性疾病,臨床主要表現(xiàn)為皮膚色素脫失進(jìn)而形成的白色的點(diǎn)或者斑片,大小從幾毫米到數(shù)厘米不等,其周圍為正常皮膚,隨著病情的發(fā)展,色素脫失癥狀會(huì)逐漸擴(kuò)大,形成更大的皮損[1-2]。遺傳和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)[3],白癜風(fēng)患者可能有一定的遺傳缺陷傾向,使黑素細(xì)胞容易被破壞,最終引起白癜風(fēng)的發(fā)生。維生素D受體基因定位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)3帶上,存在多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。研究已證實(shí)[4],維生素D受體基因與皮膚黑素細(xì)胞的數(shù)量變化有一定的關(guān)系。在此背景下,本研究即探討白癜風(fēng)維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及其與免疫異常的關(guān)系,為其臨床研究提供可參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

連續(xù)收集2011年12月—2013年1月該院皮膚科門診的白癜風(fēng)患者94例作為病例組,按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)白癜風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷,其中男性53例,女性41例,年齡8～63歲,平均年齡(28.6±8.2)歲。同時(shí)隨機(jī)選取無(wú)血緣關(guān)系的健康人群98例作為對(duì)照組,其中男性55例,女性43例,年齡8～67歲,平均年齡(28.7±8.1)歲。兩組間性別、年齡等基本資料比較差異不明顯(P＞0.05),具有臨床可比性。所有受試者均排除外傷、血液系統(tǒng)疾病、急性感染、惡性腫瘤等疾病;既往有肝腎功能不全等。納入對(duì)象均不存在血緣關(guān)系,且均簽署了知情同意書(shū),符合醫(yī)院相關(guān)管理?xiàng)l例。

1.2 方法

入院后對(duì)所有受試者的基本信息及相關(guān)病史進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查,病例組患者于入院后次日晨、對(duì)照組于參與本課題當(dāng)日同一條件下抽取所有受試者的血液樣本4 mL,其中2 mL應(yīng)用檢測(cè)外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關(guān)生化指標(biāo),另外2 mL用于提取白細(xì)胞基因組DNA。

采用PCR-RFLP技術(shù)檢測(cè)和DNA測(cè)序技術(shù)驗(yàn)證維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,所用引物均應(yīng)用軟件Premier5.0自行設(shè)計(jì),上游引物:5‘-CAACC AAGAC TACAA GTACC GCGTC AGTGA-3‘;下游引物:5‘-TGGCG GCAGC GGATG TACGT CTGC-3‘,并經(jīng)GENEBANK中BLAST分析其特異性高,由上海英俊生物技術(shù)公司合成。用的限制性內(nèi)切酶Apa I,總反應(yīng)體系20μL,包括PCR產(chǎn)物1μg,10×NEB緩沖液2μL,限制性內(nèi)切酶0.5μL(NEB公司),其余用滅菌雙蒸水填至20μL,65℃(75℃)溫育16h,3%瓊脂糖凝膠(溴化乙錠染色),電泳30 min,紫外線下觀察,攝影。將酶切產(chǎn)物與DNA片斷長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)物比較以鑒定基因型。同時(shí)分析基因多態(tài)性與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5軟件包進(jìn)行。群體代表性采用Hardy-Weinberg平衡法進(jìn)行檢測(cè),計(jì)量資料及基因型、等位基因頻率的比較采用χ2檢驗(yàn),計(jì)量資料經(jīng)檢驗(yàn)為正態(tài)分布者,且方差齊者(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因多態(tài)性分析

維生素D受體Apa I基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度為760bp,包含Apa I酶切片段。AA基因型(野生型)不能被酶切斷,僅見(jiàn)740bp1種片段;Aa基因型為雜合子,可見(jiàn)740bp、520bp和220bp3種片段;aa基因型(突變純合子)的擴(kuò)增產(chǎn)物可被完全切斷,電泳可見(jiàn)520bp和220bp2種片段。

2.2 維生素D受體基因單位點(diǎn)分析

病例組、對(duì)照組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)(P＜0.05),本研究的樣本來(lái)自同一人群,兩組間基因型比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。病例組a等位基因頻率34.04%明顯高于對(duì)照組20.41%,差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);顯性模型結(jié)果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對(duì)照組,差異比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);隱形模型結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,病例組AA+Aa基因型分布頻率較高,但差異比較不明顯(P＞0.05)(表1,2)。

表1 維生素D受體基因基因型及等位基因的分布

表2 維生素D受體基因顯性及隱性模型分析

2.3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關(guān)性

維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關(guān)性結(jié)果顯示:病例組血清IgA水平明顯低于對(duì)照組血清IgA水平,兩組間差異比較有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05);且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對(duì)照組血清IgA水平,差異比較亦有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.05);其余免疫球蛋白血清水平比較無(wú)明顯差異(P＞0.05),見(jiàn)表3。

表3 維生素D受體基因基因型與外周血免疫球蛋白相關(guān)性

3 討論

流行病學(xué)研究已證實(shí)[5],身體的任何部位均可受到白癜風(fēng)的影響,一般而言,白癜風(fēng)多為雙側(cè)對(duì)稱分布,我國(guó)每100個(gè)人中有1～2個(gè)人發(fā)病。其中半數(shù)在20歲以前就開(kāi)始出現(xiàn)皮損,且大約1/5的人有家族史。白癜風(fēng)的主要病理表現(xiàn)為白癜風(fēng)皮損處完全缺乏黑素細(xì)胞及黑素顆粒,基底層多巴染色陽(yáng)性的黑素細(xì)胞缺如[6]。

維生素D受體是一種可以介導(dǎo)1,25(OH),D發(fā)揮生物效應(yīng)的親核蛋白,是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員之一,維生素D通過(guò)與其結(jié)合可以調(diào)控相應(yīng)DNA序列結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),進(jìn)而可以參與細(xì)胞的增殖、分化等方面的調(diào)節(jié)作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)[8],Apa l酶切位點(diǎn)位于第VIII內(nèi)含子上,其多態(tài)性不影響VDR的氨基酸序列,主要通過(guò)改變基因的二級(jí)以上的結(jié)構(gòu)發(fā)揮作用。

本研究探討白癜風(fēng)維生素D受體Apa I基因多態(tài)性,結(jié)果顯示病例組a等位基因頻率高于對(duì)照組,同時(shí)顯性模型結(jié)果顯示,病例組Aa+aa基因型分布頻率高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。孫越等[9]采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法,對(duì)46例白癜風(fēng)患者和50例健康人的維生素D受體Apa I基因型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示VDR-ApaI基因AA,Aa,aa基因型分布頻率在白癜風(fēng)組分別為6.52%,21.74%,71.74%,對(duì)照組分別為12.00%,42.00%,46.00%。維生素D受體Apa I位點(diǎn)上aa基因型在白癜風(fēng)患者中頻率較高(P=0.036)。且患者組a等位基因分布頻率明顯高于正常對(duì)照組(χ2=6.142,P=0.01)。

本研究進(jìn)一步對(duì)Apa I基因多態(tài)性外周血免疫球蛋白的相關(guān)性進(jìn)行研究,結(jié)果顯示病例組血清IgA水平明顯低于對(duì)照組血清IgA水平,且Aa及aa基因型血清IgA水平亦明顯低于對(duì)照組血清IgA水平。分析可能為Aa及aa基因型引起,其中a等位基因?yàn)橹饕?。孫越等[10]采用聚合酶鏈反應(yīng)和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性方法,對(duì)46例白癜風(fēng)患者和50例健康人的 Apa I 基因多態(tài)性進(jìn)行分析,以及各基因型與外周血免疫球蛋白IgA、IgM、IgG之間的關(guān)系。結(jié)果顯示Apa I 位點(diǎn)的 aa 基因型在白癜風(fēng)患者中出現(xiàn)的頻率高于正常對(duì)照組(P＜0.05)。Aa、aa 基因型組白癜風(fēng)患者血清免疫球蛋白IgA 水平顯著低于正常對(duì)照組(P＜0.05與P＜0.01)。Ali等[11]檢測(cè)白癜風(fēng)患者血清 IgG、IgA 和 IgM 的水平,與正常人相比,IgG和 IgA水平比較低,而IgM差異不明顯,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)IgG 滴度與患者的白斑數(shù)目存在密切的相關(guān)性,因此血清免疫球蛋白可能參與了白癜風(fēng)的發(fā)病。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)[12-13],白癜風(fēng)患者血清中存在抗黑素細(xì)胞自身抗體,并且抗體滴度與疾病的面積和活動(dòng)性存在密切的相關(guān)性。其發(fā)生機(jī)制目前認(rèn)為是,自身抗體可以通過(guò)與黑素細(xì)胞膜抗原相結(jié)合進(jìn)而可以發(fā)揮補(bǔ)體的溶解作用對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行破壞[14]。亦有研究發(fā)現(xiàn)[15],白癜風(fēng)患者皮膚中殘存的凋亡分子Apaf-1可以誘導(dǎo)IgG 在體外促進(jìn)黑素細(xì)胞的凋亡。

綜上所述,本研究提示,維生素D受體Apa I基因多態(tài)性與白癜風(fēng)的發(fā)生存在密切的相關(guān)性,其可能通過(guò)影響機(jī)體的免疫功能,特別是血清IgA水平發(fā)揮作用。

[1]閔一果,黃永華.維生素D3類似物治療白癜風(fēng)分子生物學(xué)機(jī)制及臨床應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2012,9(24):162-164.

[2]邱夢(mèng)桃,余鵬,陳文靜,等.采用微衛(wèi)星標(biāo)記法對(duì)白癜風(fēng)易感基因的初步篩查研究[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2011,18(4):234-236.

[3]張建青,李建軍.白癜風(fēng)的表觀遺傳學(xué)研究進(jìn)展[J].皮膚性病診療學(xué)雜志,2012,17(5):384-386.

[5]張好勤,王培光,胡大雁,等.ZMI Z1區(qū)域單核苷酸多態(tài)性rs11593576與漢族人白癜風(fēng)臨床表型的相關(guān)性研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,6(9):934-937.

[6]郭睿,郝雁杰,汪京峽,等.VDR基因多態(tài)性與寧夏回漢族白癜風(fēng)患者的相關(guān)性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2012,16(12):2223-2226.

[9]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風(fēng)患者維生素D受體Apa I,BsmI,Fok I基因多態(tài)性分析[J].中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志,2009,23(11):695-698.

[10]孫越,韓菁,吳瑞勤,等.白癜風(fēng)患者維生素D受體Apa I基因多態(tài)性及免疫異常的研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志,2011,10(3):148-151.