周中流，尹文清，何淑君，何曉容，馮宗財(cái)，夏敬民

1湛江師范學(xué)院化學(xué)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院制藥工程系;2湛江師范學(xué)院廣東高校新材料工程技術(shù)開發(fā)中心，湛江524048

毛冬青為冬青科冬青屬植物毛冬青的干燥根，是我國(guó)南方常用的中藥材，具有清熱解毒，活血通脈，消腫止痛的作用，臨床上廣泛應(yīng)用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎、中心性視網(wǎng)膜炎和脈管炎等，有很好的療效［1］。文獻(xiàn)報(bào)道毛冬青根中的三萜皂苷類化合物具有降壓、降脂消肥、正性肌力作用、促進(jìn)血腫吸收和抗炎等功效，為其主要的活性成分［2］。近年來，毛冬青的研究主要集中在三萜皂苷的分離、純化和結(jié)構(gòu)鑒定方面［3-10］(見表1)，對(duì)該藥材中三萜皂苷的全面分析和鑒定研究未見報(bào)道。余成霞［11］等采用HPLC-UV方法對(duì)毛冬青藥材中的三萜皂苷成分分析，雖然建立了藥材的指紋圖譜，但僅鑒定了4種三萜皂苷的結(jié)構(gòu)，僅占目前文獻(xiàn)報(bào)道的皂苷數(shù)量的少部分。因此，建立一種能夠?qū)γ嘀性碥者M(jìn)行快速、全面分析的新方法，為中藥毛冬青藥材的質(zhì)量控制及以毛冬青為原料的新藥研發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

Finnigan LCQDECA電噴霧離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo-Finnigan公司)。毛冬青由桂林三金藥業(yè)股份有限公司提供，藥材經(jīng)由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為為冬青科植物毛冬青Ilex pubescens的干燥根(產(chǎn)地廣西)。甲醇、氯仿和正丁醇等均為分析純，柱層析硅膠(青島海洋化工廠，300～400目)。薄層色譜顯色用10%濃硫酸—乙醇加熱顯色;其它化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 樣品處理

取毛冬青干燥根粉末50 g，在70℃下，以500 mL 70%甲醇溶液提取5次，每次1．5 h，合并提取液，減壓濃縮得提取物3．7 g，提取物懸浮于30 mL水中，先用乙酸乙酯(30 mL×4)萃取，再用正丁醇(30 mL×6)萃取，合并正丁醇萃取液，減壓濃縮得粗皂苷2．0 g。取粗皂苷2．0 g進(jìn)行硅膠柱層析，以甲醇-氯仿-水(1∶9∶0．1→2∶8∶0．2→3．5∶6．5∶1→1∶1∶0．3，V/V)溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫250 mL，每50 mL收集一瓶，共收集20瓶。通過TLC 比較，得到 I、II、III三個(gè)組分。

2．2 質(zhì)譜條件

電噴霧正、負(fù)離子掃描模式，掃描范圍:m/z 50～2000;離子源噴射電壓5 kV;毛細(xì)管溫度250℃;毛細(xì)管電壓±5 V;殼氣(N2)流速20 L/min;離子阱壓力3．2 × 107Pa;注射泵進(jìn)樣速度1．5μL/min;多級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MSn)碰撞能量為40%。

2．3 組分Ⅰ的(±)ESI-MS分析

圖1(a)和圖1(b)分別為組分Ⅰ在正、負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜圖。在正離子ESI-MS譜中出現(xiàn)各皂苷成分的［M+Na］+準(zhǔn)分子離子峰，負(fù)離子ESI-MS譜中則為［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰。通過正、負(fù)離子質(zhì)譜的綜合推斷，確定組分Ⅰ中皂苷的分子量分別為 586、652、664、704。

為了對(duì)檢測(cè)到的各皂苷成分進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)各準(zhǔn)分子碎片離子進(jìn)行二級(jí)或三級(jí)質(zhì)譜分析。文獻(xiàn)資料表明，毛冬青中三萜皂苷按其糖鏈結(jié)構(gòu)主要分為C-3單糖鏈皂苷和C-3，28雙糖鏈皂苷。單糖鏈皂苷的二級(jí)質(zhì)譜中主要給出C-3位糖鏈依次脫去單糖基的碎片離子，而雙糖鏈皂苷則優(yōu)先在C-28位發(fā)生各單糖基的順序斷裂，脫去整個(gè)C-28位糖鏈后形成的離子峰為基峰，以之為母離子繼續(xù)進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)則出現(xiàn)C-3位糖鏈的斷裂［12］。表2給出了本研究檢測(cè)到的各皂苷成分在負(fù)離子模式下的多級(jí)質(zhì)譜中主要碎片離子的質(zhì)量數(shù)。根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［3-10］，確定組分Ⅰ中含有 ilexoside E(8)、ilexolide A(16)、pedunculoside(13)和 ilexsaponin C(24)，其中，皂苷8、13、16 為單糖皂苷，18 為雙糖皂苷(見表1)。

2．4 組分Ⅱ的(±)ESI-MS分析

圖2(a)和圖2(b)分別為組分Ⅱ在正、負(fù)離子模式下的電噴霧質(zhì)譜圖。綜合分析可以確定組分Ⅱ中三萜皂苷的分子量分別為 766、782、898、910、912和928。其中，從毛冬青中分離得到分子量為766的皂苷有3個(gè)，分別為 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)和Ziyu-glycoside I(12)，均含有兩個(gè)糖基。從結(jié)構(gòu)上分析，這三個(gè)皂苷的質(zhì)譜裂解途徑和所得產(chǎn)物的質(zhì)荷比(m/z)均相同，在電噴霧質(zhì)譜中很難一一區(qū)分。組分Ⅱ中其它三萜皂苷根據(jù)負(fù)離子模式下各準(zhǔn)分子離子峰的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確定組分Ⅱ中還含有 ilexsaponins C(18)、ilexoside J(3)、ilexoside K(4)、ilexoside H(14)和 ilexsaponin B4(11)。在我們的前期研究中［13］，證明了毛冬青中含有 ilexoside A(1)、ilexoside D(2)、ilexoside J(3)和ilexoside K(4)。

2．5 組分III的(±)ESI-MS分析

圖3(a)和圖3(b)分別為組分Ⅲ的正、負(fù)離子質(zhì)譜圖。兩者相互印證，確定組分Ⅲ中含有分子量依次為912、928、1056、1074 和1236 的皂苷類化合物。其中，分子量為912和928的化合物為組分Ⅱ中的兩個(gè)成分，已完成對(duì)其結(jié)構(gòu)的確認(rèn)。分子量為1074和1056的兩個(gè)化合物與文獻(xiàn)報(bào)道的ilexoside O(5)和pubescenosides D(15)的分子量相吻合，多級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)它們的歸屬。在組分Ⅲ的全掃描質(zhì)譜中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的化合物，分子量為1236。為了對(duì)它的結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)，本研究對(duì)其在負(fù)離子模式下的準(zhǔn)分子離子進(jìn)行多級(jí)質(zhì)譜檢測(cè)。

圖4是m/z 1235的準(zhǔn)分子離子的二級(jí)質(zhì)譜，譜中給出了基峰為m/z 911的碎片離子，同時(shí)還給出了m/z 1073、765、603和471等逐個(gè)脫去糖基的碎片離子。在負(fù)離子模式下二級(jí)質(zhì)譜中，當(dāng)毛冬青中雙糖鏈皂苷的C-28位糖鏈較短時(shí)，C-28位糖鏈上的糖基優(yōu)先順序被裂解，整個(gè)C-28位糖鏈被脫去后的離子峰為基峰，檢測(cè)不到整個(gè)C-28位糖鏈的碎片離子。通過分析圖3(a)和圖3(b)，確定m/z 911碎片離子代表苷元和3位糖鏈，同時(shí)C-28糖鏈應(yīng)該是由兩個(gè)六碳糖連接而成。文獻(xiàn)報(bào)道毛冬青中雙糖鏈皂苷的28位糖鏈通常由葡萄糖構(gòu)成，提示該皂苷的C-28位糖鏈也可能是由一個(gè)“葡萄糖-葡萄糖”結(jié)構(gòu)單元組成。為了進(jìn)一步確定3位糖鏈和該皂苷苷元的結(jié)構(gòu)，對(duì)m/z 911碎片離子進(jìn)行了三級(jí)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。離子m/z 911的三級(jí)質(zhì)譜(圖5)給出了m/z 765、603和471的碎片離子，提示3位糖鏈末端為一個(gè)六碳糖，與苷元C-3位直接相連的為一個(gè)五碳糖，糖鏈中間是一個(gè)六碳糖;根據(jù)毛冬青三萜皂苷3位糖鏈的結(jié)構(gòu)特征，該皂苷3位糖鏈很可能是由一個(gè)“木糖-葡萄糖-鼠李糖”結(jié)構(gòu)單元組成;m/z471的出現(xiàn)提示苷元可能為pubescenolic acid。該未知三萜皂苷的具體結(jié)構(gòu)需要通過分離和波譜鑒定進(jìn)一步確定。

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表2 毛冬青中皂苷的多級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 2 Multiple-stagemass spectra of saponins from Ilex pubescens

注:*對(duì)此碎片離子進(jìn)行MS3檢測(cè)。Note:*The characteristic ion was determined by MS3．

3 討論

電噴霧多級(jí)質(zhì)譜因?yàn)槠渚哂徐`敏度高、分析速度快和消耗樣品少等優(yōu)點(diǎn)，適于分析皂苷結(jié)構(gòu)。電噴霧質(zhì)譜不僅可以直接用于確定混合皂苷中各單體皂苷的分子量，還可以通過多級(jí)質(zhì)譜確定已知甚至未知的單體皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)。本研究利用全掃描電噴霧質(zhì)譜結(jié)合硅膠柱層析方法對(duì)毛冬青根中的皂苷進(jìn)行快速分析。通過多級(jí)質(zhì)譜得到一系列皂苷的苷元和糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，確認(rèn)了其中11個(gè)已知的皂苷成分。同時(shí)，利用多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的1個(gè)未見文獻(xiàn)報(bào)道的皂苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了合理的推測(cè)。本方法與HPLC-ESI-MS-MS技術(shù)相比，具有操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)。

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