宋珺玲，周惠明，朱科學(xué)

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

作為產(chǎn)茶大國，我國茶飲料產(chǎn)業(yè)生成的茶渣高達(dá)幾十萬噸，茶渣半纖維素多糖是茶渣中溶于堿性溶液中的那一部分非纖維素多糖，占茶渣干重的20%左右，與小麥等其他來源的半纖維素不同，綠茶茶渣半纖維素中半乳糖含量很高[1]，是一種有待開發(fā)的特殊半纖維素種類。目前國內(nèi)外對半纖維素的研究多集中在半纖維素提取方法、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上[2-6]，來源涉及小麥、稻草秸稈以及一些樹木半纖維素[7]，少有研究茶渣半纖維素。本文以綠茶茶渣為原料，利用堿性過氧化氫法提取茶渣半纖維素，發(fā)現(xiàn)一種新的半纖維素種類，為茶渣的進(jìn)一步研究和綜合利用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

茶渣 浙江塔塔茶葉有限公司；NaOH、H2O2、無水乙醇、半乳糖、3，5-二硝基水楊酸 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

分析天平 奧豪斯儀器上海有限公司；THS-10精密型超級恒溫水槽 寧波天恒儀器廠；84-1A磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司；CR21GⅢ冷凍離心機(jī) 日本HITACH KOKI公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；RJLDL-50G低速大容量多管離心機(jī) 無錫瑞江分析儀器有限公司；冷凍干燥機(jī) 美國LABCONCO公司；FORMA702超低溫冰箱 THERMO LIFE SCIENCE。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茶渣半纖維素的提取及分離流程 茶渣→烘干→粉碎過40目篩→堿性過氧化氫法提取→離心取上清液→調(diào)pH→真空濃縮→脫蛋白（Sevage法）反復(fù)多次→醇沉→離心，得沉淀→冷凍干燥，研磨得茶渣半纖維素粉末。

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 原料預(yù)處理 將從茶飲料企業(yè)中取來的茶渣經(jīng)45℃烘干16h后粉碎，過40目篩，得到茶渣粉末。

1.2.2.2 提取 準(zhǔn)確稱取10g茶渣粉末，添加含0.75%NaOH、3%H2O2的水溶液200mL，70℃，攪拌提取2h。

1.2.2.3 離心 將浸提液在4000r/min離心15min，得上清液。

1.2.2.4 調(diào)節(jié)pH 用1mol/L的HCl調(diào)節(jié)上清液的pH到5～7。

1.2.2.5 真空濃縮 將浸提液在55℃濃縮到原體積的1/5。

1.2.2.6 脫蛋白 采用Sevage法[8]，即將氯仿和丁醇溶液按v∶v=5∶1的比例加到濃縮液中，混合物劇烈振搖5min后靜置萃取，分去水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，得脫蛋白溶液，反復(fù)多次至水與溶液層交界處無明顯蛋白沉淀為止。

1.2.2.7 醇沉、干燥 加入3倍上述脫蛋白糖液體積的無水乙醇溶液，室溫下放置過夜，4000r/min離心15min得茶渣半纖維素沉淀，冷凍干燥，研磨，得黃褐色粉末狀茶渣半纖維素。

1.2.3 茶渣半纖維素得率的計(jì)算

1.2.4 茶渣半纖維素中總糖含量的測定 利用DNS法（3，5-二硝基水楊酸法）測定半纖維素中總糖含量。DNS法利用抽提試劑在高溫條件下水解半纖維素產(chǎn)生混合單糖（半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖），與DNS試劑顯色后測定總糖含量：準(zhǔn)確稱取6.3g 3，5-二硝基水楊酸法，溶于262mL 2mol/L的氫氧化鈉溶液，再加到500mL含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，繼續(xù)添加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，定容至1000mL，貯存于棕色瓶中。準(zhǔn)確稱取100mg半乳糖（105℃烘干至恒重）溶于100mL容量瓶中，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL半乳糖液加入比色管，分別定容到2mL，再分別加入1.5mL DNS顯色液，沸水浴5min，冷卻到室溫定容至25mL，540nm下測吸光度值，得到半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：A=0.669c-0.025，R2=0.997，其中A為吸光度值，c為半乳糖含量，單位為mg。

半纖維素總糖含量的測定：稱取50mg茶渣半纖維素，加少量蒸餾水溶脹后定容至25mL，利用DNS法顯色后測定A540，總糖含量計(jì)算公式如下：

1.3 茶渣半纖維素的理化性質(zhì)和表征

1.3.1 茶渣半纖維素的理化性質(zhì) 碘-碘化鉀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、福林酚反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、咔唑硫酸反應(yīng)；配制1mg/mL的半纖維素溶液，分別進(jìn)行碘-碘化鉀反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、福林酚反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、咔唑硫酸法實(shí)驗(yàn)，定性檢測是否含有淀粉、蛋白質(zhì)、多酚以及糖醛酸。I-KI反應(yīng)實(shí)驗(yàn)以淀粉作為對照；考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)以牛血清蛋白作為對照，595nm條件下比色確定；福林酚實(shí)驗(yàn)以沒食子酸作為對照，765nm條件下比色確定；咔唑硫酸反應(yīng)中以葡萄糖醛酸作為對照，530nm條件下比色鑒定。

1.3.2 半纖維素的表征

1.3.2.1 紅外光譜分析 將干燥的茶半纖維素3mg與KBr研磨壓片，在4000～500cm-1區(qū)域內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[9]。

1.3.2.2 茶渣半纖維素中單糖組成的離子色譜分析取5mg/mL多糖樣品100μL，加入4mol/L的三氟乙酸（TFA）100μL，抽真空封管，110℃水解2h，冷卻揮發(fā)TFA。0.45μm微孔濾膜過濾，用去離子水定容到5mL。樣品進(jìn)入離子色譜分析[10]。離子色譜分析條件：色譜柱：CarboPacPA20（3mmi.d.×150mm）；流速：0.5mL/min；檢測器：脈沖安培檢測器；流動相為H2O、250mmol/L NaOH及1mol/L NaAc。不同濃度梯度洗脫，濃度如表1所示。

表1 離子色譜測單糖組成的流動相組成Table 1 The composition of mobile phase in sugar analysis by ion chromatography

進(jìn)樣濃度為3.33μg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品為鼠李糖、阿拉伯糖、氨基半乳糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸。通過比較標(biāo)準(zhǔn)單糖和樣品的保留時間，確定樣品中的單糖和糖醛酸種類，再根據(jù)峰面積計(jì)算單糖和糖醛酸的百分比。

1.3.2.3 茶渣半纖維素的相對分子量分析 采用Waters 600高效凝膠過濾色譜（HPGPC）測定相對分子質(zhì)量。具體操作條件為：色譜柱Ultrahydrogel TM Linear（300mm×7.8mm）；流動相：0.1mol/L NaNO3；流速：0.9mL/min；柱溫：45℃；檢測器：2410示差折光檢測器；樣品制備：樣品溶解于流動相中，用微孔過濾膜過濾后供進(jìn)樣[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶渣半纖維素的提取

通過堿性過氧化氫法提取、乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白的方法對茶渣中半纖維素進(jìn)行提取，所得茶渣半纖維素經(jīng)過冷凍干燥研磨粉碎后，得到黃褐色固體粉末，得率為34.6%，其中總糖含量為34.5%±0.5%。

2.2 茶渣半纖維素的理化性質(zhì)分析

茶渣半纖維素為黃褐色的固體粉末；不溶于高濃度乙醇等有機(jī)溶劑；酸水解液與3，5-二硝基水楊酸反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含糖[12]；與KI-I2反應(yīng)呈陰性，說明樣品中不含淀粉；與考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含蛋白質(zhì)[13]；與福林酚-NaCO3反應(yīng)呈陽性，說明樣品中含酚類物質(zhì)；與咔唑硫酸試劑反應(yīng)呈陽性，說明茶渣半纖維素中含有糖醛酸[14]。由以上結(jié)果可知，茶葉在熱處理提取水溶性成分之后，剩余茶渣中仍殘留蛋白質(zhì)和微量酚類物質(zhì)，所以經(jīng)堿性過氧化氫法分離的茶渣半纖維素粗多糖中還含有一部分蛋白質(zhì)和多酚；而且通過糖醛酸實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)樣品中含有很多糖醛酸類物質(zhì)，說明茶渣半纖維素很可能是一種酸性多糖。

2.3 茶渣半纖維素的表征

2.3.1 紅外光譜分析 茶渣半纖維素的紅外光譜見圖1。由圖1可知，在3600～3200cm-1處出現(xiàn)的寬峰是半纖維素的O-H伸縮振動，2935cm-1吸收為多糖的C-H伸縮振動峰。1638.67cm-1處出現(xiàn)的峰為CHO的C=O的非對稱伸縮振動峰，代表了半纖維素多糖的自由羧基官能團(tuán)（-COO-），1413cm-1出現(xiàn)的峰屬于C-H鍵的變角振動，它和C-H鍵的伸縮振動構(gòu)成了糖類的特征吸收峰。在1200～1000cm-1之間的吸收峰是由兩種C-O鍵伸縮振動所形成，其中一種1044.94cm-1為CO-C的伸縮振動峰，是糖環(huán)中醚鍵的特征吸收。在895cm-1附近處的吸收峰是β-型的C-H直立鍵，表明糖單元之間存在β-糖苷鍵連接[12]。D-葡萄吡喃環(huán)對稱性伸縮振動出現(xiàn)在775cm-1，說明茶渣半纖維素中含有有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)[10]。877.13cm-1處出現(xiàn)的吸收峰很可能是呋喃糖中次甲基橫向振動所造成的尖峰，所以茶渣半纖維素很可能同時含有吡喃糖和呋喃糖。

圖1 茶渣半纖維素紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectrogram of hemicellulose isolated from green tea-leaf

2.3.2 茶渣半纖維素中單糖組成分析 標(biāo)準(zhǔn)單糖和糖醛酸以及茶渣半纖維素的液相色譜見圖2和圖3，根據(jù)液相色譜的保留時間，進(jìn)行定性分析，即通過比較標(biāo)準(zhǔn)單糖和樣品中單糖的保留時間得出樣品中的單糖組成，再根據(jù)峰面積和標(biāo)樣的摩爾濃度計(jì)算出樣品中個單糖的百分比。結(jié)果表明，茶渣半纖維素主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成，還包括少量鼠李糖、木糖和氨基半乳糖，其百分比為：32.8∶24.6∶34.4∶3.9∶4∶0.3；不同于其他原料，茶渣中的半纖維素成分結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同時含有五碳糖和六碳糖，且并不同于其他以木糖為主鏈的半纖維素，但是僅僅通過紅外無法預(yù)測茶渣半纖維素的整體結(jié)構(gòu)，其結(jié)構(gòu)特性還有待繼續(xù)研究。此外，茶渣半纖維素還含有半乳糖醛酸，與總糖含量的百分比是38∶100，表明茶渣半纖維素是一種酸性多糖。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的離子色譜圖Fig.2 Ion chromatograph chart of standard monosaccharide

圖3 樣品中單糖的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatograph chart of hemicelluloses

圖4 HPGFC法測定60%乙醇沉淀組分分子量Fig.4 The MW of 60%ethanol concentration component determined by HPGFC

圖5 HPGFC法測定80%乙醇沉淀組分分子量Fig.5 The MW of 80%ethanol concentration component determined by HPGFC

2.3.3 茶渣半纖維素的相對分子量 利用不同濃度乙醇將半纖維素初步分級，發(fā)現(xiàn)60%濃度和80%濃度乙醇沉淀的組分有很好的水溶解性，將該組分通過高效凝膠色譜分析，可以看出高濃度乙醇沉淀的組分較為均一，其凝膠色譜圖分別見圖4和圖5。從圖4可以看出，60%組分較為均一，重均分子量為2073；從圖5看出，80%包括有兩個峰，重均分子量分別為1858和425。結(jié)果表明在堿性過氧化氫條件下，提取的半纖維素分子量分布在2000和400左右，是一種小分子多糖。與堿法提取的半纖維素相比，分子量偏低[15]，原因可能以下幾個方面：a.現(xiàn)有報(bào)道中的半纖維素多來源于多年生草本、硬木等，其植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)致密，半纖維素分子量較大，而茶渣半纖維素來源于茶葉嫩葉，半纖維素分子量相對較??；b.因?yàn)檫^氧化氫的存在，降低了半纖維素的聚合度[16]，增加半纖維素的溶解性所致；c.高濃度乙醇沉淀的組分側(cè)鏈取代度高[17]，易溶于水，與纖維素結(jié)合不緊密，相對分子量較低。

3 結(jié)論

3.1 采用堿性過氧化氫法分離，經(jīng)過乙醇沉淀、Sevage法脫蛋白、冷凍干燥等方法從茶渣中提取得到黃褐色呈固體粉末狀的半纖維素，得率為34.6%。

3.2 紅外圖譜顯示，茶渣半纖維素具有吡喃糖的特征吸收，并且存在β-型糖苷鍵。

3.3 單糖分析結(jié)果顯示，茶渣半纖維素含有多種單糖，主要是半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖，還含有少量鼠李糖、木糖和微量氨基半乳糖，其百分比為32.8∶24.6∶34.4∶3.9∶4∶0.3；茶渣半纖維中的糖醛酸為半乳糖醛酸，其含量與總糖含量百分比為38∶100，所以茶渣半纖維素為一種酸性多糖。

3.4 通過對高濃度乙醇沉淀的半纖維素做分子量分析，發(fā)現(xiàn)水溶性的半纖維素具有很高的均一性，且分子量較小。

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