魯海珍 劉尚梅

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，預(yù)后較差，是全球癌癥第二死因［1］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多基因參于的多步驟過程，其中包括控制細(xì)胞增殖的抑癌基因失活和促進(jìn)細(xì)胞增殖的癌基因激活。E-鈣粘附素（E-cadherin）是鈣離子介導(dǎo)的跨膜糖蛋白家族中一員，其結(jié)構(gòu)和功能異?？蓪?dǎo)致細(xì)胞間粘附能力減弱，在腫瘤形成及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。環(huán)氧合酶（cy?clooxygenase：COX）-2是一種誘導(dǎo)型前列腺素合成過程中的限速酶，它將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產(chǎn)物，參與維持機(jī)體的各種生理和病理功能［2］。本研究通過對胃癌及癌旁組織上述蛋白表達(dá)情況的檢測，對比腫瘤與癌旁組織及臨床病理指標(biāo)的關(guān)系，探討二者在胃癌診斷及進(jìn)展預(yù)后等方面的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2005年2月至2006年10月中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院外科行胃癌根治術(shù)手術(shù)患者病例121例，術(shù)前均未行放化療?；举Y料：男96例（79.3%），女25例（20.7%）；≥50歲101例（83.5%），＜50歲20例（16.5%）；賁門45例（37.2%），胃體28例（23.1%），胃竇42例（34.7%），全胃6例（5.0%）；腫瘤體積≥6 cm 75例（62.0%）。對所有病例進(jìn)行病理切片復(fù)閱，選取腫瘤及癌旁黏膜位點(diǎn)進(jìn)行組織微陣列制作。由于脫片，最終對121例胃癌及113例癌旁黏膜行E-cad?herin，對118例胃癌及111例癌旁行COX-2免疫組織化學(xué)檢測。

1.2 組織芯片制作

結(jié)合原HE切片，選取有代表性的腫瘤、瘤旁、遠(yuǎn)端黏膜等位點(diǎn)在供體蠟塊做出標(biāo)記，對應(yīng)取材，打入受體蠟塊相應(yīng)孔中，取材鋼針內(nèi)徑為0.6 mm，深度3.0 mm。受體蠟塊制作完成后，4 μm厚度切片，70℃烤片1 h，室溫保存，以備免疫組織化學(xué)檢測。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

所選抗體均購自福州邁新生物技術(shù)公司，均為工作液。E-cadherin為鼠抗人單克隆抗體，克隆號(hào)為A42C7；COX-2為兔抗人單克隆抗體，克隆號(hào)為SP21。實(shí)驗(yàn)步驟采用S-P法，石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精水化后進(jìn)行抗原修復(fù)，具體為pH6.0枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，微波爐加熱?？乖迯?fù)盒內(nèi)液體溫度保持在95℃并持續(xù)20 min，試劑A阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，試劑B封閉血清，一抗4℃過夜，試劑C信號(hào)放大，DAB染色及封片。

1.4 結(jié)果判讀

免疫組化結(jié)果根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)目比例及著色強(qiáng)度判斷，＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，＞50%為3分。未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。以二者得分相乘，0分記為陰性（-），1～3分為弱陽性（1+），4分為中度陽性（2+），6分和9分為強(qiáng)陽性（3+）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 16.0 for windows軟件包，采用Pearson卡方檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對121例腫瘤組織進(jìn)行E-cadherin免疫組織化學(xué)染色（圖1），表達(dá)陽性為93例（76.9%），陰性28例（23.1%），弱陽、中陽和強(qiáng)陽性的表達(dá)率分別為33.9%、42.1%和0.9%，對比臨床病理指標(biāo)，顯示該蛋白表達(dá)與腫瘤大體分型（P=0.014）、Lauren分型（P=0.001）、腫瘤分化（P=0.004）及pTNM分期（P=0.024）等顯著相關(guān)（表1）。結(jié)果顯示浸潤型、Lauren分型為彌漫型、腫瘤分化差及pTNM分期高的腫瘤組織E-cad?herin缺失或弱表達(dá)要顯著高于局限型分化好及分期早的腫瘤。E-cadherin蛋白表達(dá)與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性。113例癌旁黏膜組織E-cadherin均呈陽性表達(dá)，E-cadherin在腫瘤及癌旁黏膜組織表達(dá)之間無顯著相關(guān)性（P=0.673）。

圖1 E-cadherin蛋白免疫組化強(qiáng)陽性表達(dá)（S-P法×100）Figure 1 E-cadherin expression determined by immunohistochemistry（SP method× 100）

表1 E-cadherin蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性 （例%）Table 1 Association of E-cadherin protein expression with clinicopathologic characteristics

檢測118例胃癌腫瘤組織COX-2蛋白表達(dá)（圖2），陽性率為38.1%（45/118），主要為弱陽-中等強(qiáng)度表達(dá)，無強(qiáng)陽性表達(dá)。對比COX-2蛋白表達(dá)與臨床病理指標(biāo)相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，其過表達(dá)僅與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目顯著相關(guān)（P=0.048，表2），胃癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移COX-2陰性率為82.6%（19/23），陽性率為17.4%（4/23），伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組織COX-2陰性率為56.8%（54/95），陽性率為43.2%（41/95），顯著高于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移者。結(jié)果還顯示COX-2陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為74.0%（54/73），弱陽表達(dá)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為89.2%（33/37），中陽轉(zhuǎn)移率為100%（8/8），隨著COX-2蛋白表達(dá)由陰性至陽性，由弱至強(qiáng)的表達(dá)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率也顯著增高。COX-2蛋白表達(dá)與腫瘤大小、大體分型、浸潤深度、腫瘤分化、病理分期等無明顯相關(guān)性。對111例相應(yīng)癌旁組織檢測COX-2蛋白表達(dá)，癌旁黏膜組織COX-2陰性、弱陽及中陽比率分別為22.5%（25/111）、62.2%（69/111）和15.3（17/111），與腫瘤組織COX-2蛋白表達(dá)比率對比無顯著相關(guān)性（P=0.274）。

圖2 COX-2蛋白免疫組化陽性表達(dá)（S-P法×100）Figure 2 COX-2 expression determined by immunohistochemistry（SP method× 100）

表2 COX-2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)性 （例%）Table 2 Association of COX-2 protein expression with lymph node metastasis

3 討論

E-cadherin作為細(xì)胞粘附分子家族中與腫瘤關(guān)系最密切成員而倍受關(guān)注，多數(shù)與胃癌相關(guān)性研究的報(bào)道均顯示其表達(dá)降低與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移相關(guān)，E-cadherin蛋白表達(dá)陽性的胃癌患者3年和5年生存率較陰性患者明顯延長［3，4］。一項(xiàng)對4 383例胃癌患者E-cadherin蛋白表達(dá)的meta分析顯示，其表達(dá)下調(diào)與TNM分期、腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化、血管浸潤、組織學(xué)分型及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等顯著相關(guān)［5］。本研究顯示E-cadherin低表達(dá)或陰性與腫瘤分化差、病理分期高有關(guān)，這一結(jié)果提示腫瘤的分化與細(xì)胞粘附性相關(guān)，而缺乏粘附性的腫瘤易發(fā)生區(qū)域淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后相對較差。本研究結(jié)果未提示E-cadherin與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，但多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道二者具有相關(guān)性［6，7］，這一結(jié)果可能需要我們擴(kuò)大樣本量繼續(xù)觀察。在預(yù)測胃癌患者預(yù)后方面，血漿可溶性E-cadherin也許是一項(xiàng)備選的標(biāo)記物，有研究顯示在胃癌患者可溶性E-cadherin水平越高，患者預(yù)后越差，尤其是高于10 000 ng/mL的90%胃癌患者生存率不超過3年［8］。

本研究同時(shí)檢測了癌旁粘膜組織E-cadherin蛋白表達(dá)，顯示腫瘤旁粘膜均呈陽性表達(dá)，進(jìn)一步提示其在腫瘤發(fā)生中具有重要意義。

COX-2是一種誘導(dǎo)型前列腺素合成過程中的限速酶，其輔助產(chǎn)生的各種前列腺素產(chǎn)物在維持腫瘤生長、促進(jìn)腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示COX-2蛋白在腫瘤中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。COX-2蛋白表達(dá)越強(qiáng)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率越高，對胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的判斷具有一定臨床意義，尤其對于活檢或早期胃癌病例，是否可以作為預(yù)測有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物之一值得探討，類似結(jié)果國內(nèi)外均有報(bào)道［9，10］。關(guān)于 COX-2高表達(dá)胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討及研究，有學(xué)者同時(shí)檢測胃癌標(biāo)本中COX-2、VEGF-C蛋白表達(dá)及淋巴血管密度，比較之間關(guān)系，試圖解釋這一科學(xué)問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)與VEGF-C上調(diào)后促進(jìn)淋巴血管密度增生之間無顯著相關(guān)性［11］。本研究未顯示COX-2與腫瘤大小、浸潤深度、分化程度及臨床病理分期相關(guān)。但有研究顯示COX-2與胃癌上述指標(biāo)顯著相關(guān)，為獨(dú)立預(yù)后因子［12-14］，腫瘤直徑＞6 cm的胃癌COX-2蛋白表達(dá)水平顯著高于＜6 cm，T4病變COX-2表達(dá)水平顯著高于T3、T2和T1病變。提示較大的腫瘤可能產(chǎn)生較多COX-2及前列腺素，維持腫瘤生長。

E-cadherin及COX-2均為胞膜著色，前者表達(dá)降低和后者的高表達(dá)均提示腫瘤進(jìn)展趨勢，二者分別從不同方面如腫瘤分化、分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯示出上述特性，因此二者聯(lián)合檢測可達(dá)到互補(bǔ)目的，對胃癌患者預(yù)后具有一定提示意義。

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