李 藩，李仁輝，于曉章，邵繼海＊＊

(1:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，長沙 410128)

(2:中國科學(xué)院水生生物研究所，武漢 430072)

1990s 以來，我國淡水水體富營養(yǎng)化日趨嚴(yán)重.2009年中國環(huán)境狀況公報顯示，26 個國控重點湖泊(水庫)中，Ⅳ、Ⅴ和劣Ⅴ類水質(zhì)湖泊(水庫)所占比例分別為23.1%、19.2%和34.6%，而Ⅱ、Ⅲ類水質(zhì)湖泊(水庫)分別只占3.9%和19.2%.一些大型湖泊先后暴發(fā)了嚴(yán)重的藍藻水華，如滇池、巢湖、太湖等.因此藍藻水華的削減與消除對于保證水體水質(zhì)安全非常重要.

目前化學(xué)除藻是水體，特別是小型水體，藍藻水華去除的主要方法，該方法除藻效果好、見效快.然而，絕大部分化學(xué)除藻劑(如CuSO4)、除草劑等會給環(huán)境帶來二次污染[1]，即使有些化學(xué)除藻劑(如H2O2)不會對環(huán)境造成二次污染，但是這些化學(xué)除藻劑對水生生物毒性作用沒有選擇性，使用這類除藻劑后往往會造成該水體生態(tài)系統(tǒng)的崩潰.生物源物質(zhì)是一類來自生物體的物質(zhì)，絕大部分生物源物質(zhì)安全性好，易于降解，對環(huán)境的影響小，而且有些生物源物質(zhì)對藍藻具有選擇性抑制作用[2].以對藍藻有選擇性抑制作用的生物源物質(zhì)除藻兼具化學(xué)除藻方法的除藻效果好、見效快等優(yōu)點及生物材料生態(tài)安全性好的優(yōu)點.這些優(yōu)點決定了生物源抑藻物質(zhì)在快速、安全去除藍藻水華方面具有巨大的應(yīng)用潛力.

銅綠微囊藻是我國最常見的水華藍藻種類，也是產(chǎn)微囊藻毒素的主要種類之一.我們的前期研究結(jié)果表明小麥麩皮水浸提液(Wheat Bran Leachate，WBL)對銅綠微囊藻具有較強的抑制作用[3]，而且在對銅綠微囊藻有效抑藻濃度內(nèi)對蛋白核小球藻、斜生柵藻及水體一些常見的浮游細(xì)菌均無明顯抑制作用.從抑藻效應(yīng)來看，WBL 的抑藻效應(yīng)要比大麥秸稈的抑藻效應(yīng)強[3]，而歐洲的一些水庫已經(jīng)開始應(yīng)用大麥秸稈來控制水體藍藻水華，并取得良好的效果[4].我國小麥年產(chǎn)量為一億噸左右，小麥麩皮是小麥加工的副產(chǎn)品，來源廣泛.由此可見利用WBL 削減水體藍藻水華具有較大的應(yīng)用潛力.

光合放氧生物的葉綠素光誘導(dǎo)熒光與PSⅡ反應(yīng)中心及反應(yīng)中心電子供體側(cè)和受體側(cè)氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)[5-6].Strasser 等[7]在生物膜能量流動理論基礎(chǔ)上建立了葉綠素光誘導(dǎo)熒光動力學(xué)曲線分析方法——JIP-test.JIP-test 能較好地反映PSⅡ反應(yīng)中心及電子供體側(cè)和受體側(cè)的生理狀態(tài)，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于環(huán)境脅迫對藍藻PSⅡ結(jié)構(gòu)與功能的影響等方面的研究[8-10].為了研究WBL 脅迫對銅綠微囊藻光合系統(tǒng)的影響，本文探討了WBL 脅迫下銅綠微囊藻光合色素含量及葉綠素光誘導(dǎo)熒光動力學(xué)特征的變化，并在此基礎(chǔ)上分析了WBL 對銅綠微囊藻光合系統(tǒng)Ⅱ作用的靶位點.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗選用的銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa CHAB-109)由中國科學(xué)院水生生物研究所有害藻類生物學(xué)學(xué)科組提供，藻株用CT 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)[11]，培養(yǎng)條件為光強30 μmol potons/(m2·s)，溫度25 ±1℃，光暗比12 h∶12 h(L∶D).供試藻株在實驗前進行了純化除菌處理，具體方法為:將培養(yǎng)好的M.aeruginosa CHAB-109 培養(yǎng)液先用0.8 μm 無菌濾膜過濾除去小的浮游細(xì)菌，再用新配置的無菌CT 培養(yǎng)基重懸、重復(fù)上述過濾操作;然后將藻細(xì)胞重懸在新配置的無菌CT 培養(yǎng)液中，將其置于超聲波清洗儀中低頻處理5 min，使微囊藻附著細(xì)菌游離，再重復(fù)上述過濾除菌和藻細(xì)胞重懸操作，最后用CT 固體培養(yǎng)基對重懸藻細(xì)胞進行劃線純化處理，挑取單藻細(xì)胞菌落作為出發(fā)藻株進行實驗.小麥麩皮來自河南省安陽縣種植的小麥，品種為眾麥1 號.

1.2 小麥麩皮水浸提液制備

稱取8 g 小麥麩皮，加入到1 L ddH2O 中，然后置于濕熱蒸汽滅菌鍋于115℃滅菌15 min，滅菌后的水浸提液于12000 g 離心10 min，上清液即為小麥麩皮水浸提液(WBL).

1.3 銅綠微囊藻細(xì)胞色素含量及葉綠素光誘導(dǎo)熒光動力學(xué)的測定

實驗在250 ml 的三角瓶中進行，將WBL 與等體積的2×CT 培養(yǎng)基混合，然后加入20 ml 用CT 培養(yǎng)基培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的M.aeruginosa CHAB-109，再加入CT 培養(yǎng)基使終體積為100 ml.WBL 終濃度設(shè)置為0、0.8、1.6、3.2 g/L(相當(dāng)于制備WBL 時的小麥麩皮干重(W/V)).所有處理均置于上述培養(yǎng)條件下于80轉(zhuǎn)/min 震蕩培養(yǎng).藻細(xì)胞葉綠素和類胡蘿卜素含量按Richards 等[12]所述方法用80%丙酮提取測定.藻細(xì)胞濃度用血球計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù).M.aeruginosa CHAB-109 葉綠素光誘導(dǎo)熒光多相瞬態(tài)上升動力學(xué)用Handy-PEA(Handy-Plant Efficiency Analyser，Hansatech Instruments，UK)測定，光化光強度為3000 μmol potons/(m2·s)，熒光瞬時上升曲線的記錄時間為50 μs ～1 s，采樣速率在前2 ms 之內(nèi)是105次/s，2 ms 之后為103次/s.熒光測定前所有樣品暗適應(yīng)15 min.

1.4 葉綠素?zé)晒舛嘞嗨矐B(tài)上升動力學(xué)參數(shù)分析

根據(jù)Strasser 等的能量流動模型圖(圖1)[7]，分析PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動比活性能參數(shù)(ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC)和 PSⅡ能量分配比率參數(shù)(ψ0、φP0、φE0).各參數(shù)具體含義如表 1 所示[13].

表1 葉綠素?zé)晒舛嘞嗨矐B(tài)上升動力學(xué)參數(shù)Tab.1 Parameters derived from polyphasic rise in chlorophyll fluorescence transients

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 13.1 進行單因素方差分析(One-Way ANOVA，LSD)，P ＜0.05 被認(rèn)為具有顯著差異.

圖1 Strasser 和Strasser 簡化的能量在光合器官中的流動模型Fig.1 Strasser and Strasser proposed simplified scheme for the energy cascade from light absorption to electron transport

2 結(jié)果與分析

2.1 WBL對M.aeruginosa CHAB-109細(xì)胞色素含量的影響

當(dāng) WBL 濃度為 0.8 g/L 時，M.aeruginosa CHAB-109 單位細(xì)胞內(nèi)Chl.a 與類胡蘿卜素含量在第1 d 與對照(CK)相比無顯著差異，盡管從平均值來看，在第3 d 和第5 d 其Chl.a 與類胡蘿卜素含量均比對照低，但是統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，其差異均沒有達到顯著水平.當(dāng) WBL 濃度為 1.6 g/L 時，M.aeruginosa CHAB-109 單位細(xì)胞內(nèi)Chl.a 與類胡蘿卜素含量在第1 d 與對照相比無顯著差異，但是在第3 d 和第5 d 均顯著低于對照.當(dāng)WBL 濃度為3.2 g/L 時，M.aeruginosa CHAB-109 單位細(xì)胞內(nèi)Chl.a 與類胡蘿卜素含量在第1 d 即顯著低于對照(圖2).

圖2 WBL 脅迫對M.aeruginosa CHAB-109 單位細(xì)胞內(nèi)Chl.a 含量(A)和類胡蘿卜素含量(B)的影響(* 代表差異顯著，下同)Fig.2 Effect of WBL stress on the cellular Chl.a contents(A)and cellular carotenoids contents(B)of M.aeruginosa CHAB-109

2.2 WBL 對M.aeruginosa CHAB-109PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動比活性能的影響

在 WBL 脅迫后的第 1 d，當(dāng) WBL 濃度為 1.6 和 3.2 g/L 時，M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ的 ABS/RC 值顯著低于對照;對于TR0/RC、ET0/RC 而言，只有當(dāng)WBL 濃度達到3.2 g/L 時才顯著低于對照.到了第3 d，當(dāng)WBL 濃度為0.8 g/L 時，ABS/RC、TR0/RC、ET0/RC 3 個比活性能參數(shù)與對照相比均無顯著差異;當(dāng)WBL濃度為1.6 和3.2 g/L 時，這3 個比活性能參數(shù)均顯著低于對照(圖3).

圖3 WBL 脅迫對M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ單位反應(yīng)中心能量流動比活性能參數(shù)的影響(A:1 d;B:3 d)Fig.3 Effect of WBL stress on the parameters of energy fluxes per reaction centre of M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ(A:1 d;B:3 d)

2.3 WBL對M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ能量流動分配比率的影響

在 WBL 脅迫后的第 1 d，當(dāng) WBL 濃度為 0.8 g/L 時，3 個 PSⅡ能量分配比率參數(shù)(ψ0、φP0、φE0)與對照相比均無顯著差異;當(dāng)WBL 濃度達到1.6 g/L 時，ψ0與對照相比無顯著差異，而 φP0和 φE0卻顯著高于對照;當(dāng)WBL 濃度達到3.2 g/L 時，φP0與對照相比均無顯著差異，而 ψ0和 φE0卻顯著低于對照(圖4A).在WBL 脅迫后的第3 d，當(dāng) WBL 濃度為1.6 和3.2 g/L 時，ψ0和 φE0均顯著低于對照;在各 WBL 濃度脅迫下，φP0與對照相比均無顯著差異(圖4B).

圖4 WBL 脅迫對M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ能量分配比率參數(shù)的影響(A:1 d;B:3 d)Fig.4 Effect of WBL stress on the parameters of flux ratios of M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ(A:1 d;B:3 d)

3 討論

藻類和植物均為光合放氧生物，它們具有相似的光合系統(tǒng)結(jié)構(gòu).葉綠素光誘導(dǎo)熒光動力學(xué)可以反映光合放氧生物PSⅡ的結(jié)構(gòu)與功能[14].由于葉綠素光誘導(dǎo)熒光對環(huán)境脅迫響應(yīng)非常靈敏，所以葉綠素光誘導(dǎo)熒光動力學(xué)現(xiàn)在已被廣泛應(yīng)用于植物[14-16]和藍藻對環(huán)境脅迫的響應(yīng)[8-10].

ABS/RC 表示單位反應(yīng)中心吸收的光能.當(dāng)WBL 濃度為1.6 和3.2 g/L 時，M.aeruginosa CHAB-109 PSⅡ的ABS/RC 顯著低于對照，這也就意味著在這2 個濃度下，WBL 脅迫降低了其反應(yīng)中心吸收的光能.WBL 脅迫可以顯著降低單位細(xì)胞內(nèi)的Chl.a 含量(圖2)，這可能是因為WBL 脅迫導(dǎo)致該藻反應(yīng)中心吸收的光能降低.

根據(jù)Strasser 等的能量流動模型圖[7]，φP0可以反映PSⅡ反應(yīng)中心電子供體側(cè)的電子傳遞性能.實驗結(jié)果顯示，當(dāng) WBL 濃度為1.6 g/L 時，在 WBL 脅迫的第1 d 該藻的 φP0值略高于對照，但是到了第3 d，φP0值與對照相比沒有顯著差異.這可能與M.aeruginosa CHAB-109 受到WBL 脅迫的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān).在WBL 脅迫的第3 d，3 個濃度的WBL 脅迫對該藻的φP0值均沒有顯著影響，這表明M.aeruginosa CHAB-109 的PSⅡ反應(yīng)中心電子供體側(cè)不是WBL 的抑制作用位點.

ψ0可以反映PSⅡ反應(yīng)中心電子受體側(cè)的性能[8].本文的結(jié)果顯示ψ0對WBL 脅迫表現(xiàn)敏感，當(dāng)WBL 濃度為3.2 g/L 時，ψ0值在第1 d 就顯著低于對照，而在 WBL 脅迫的第3 d，1.6 g/L 的WBL 就能抑制該藻的ψ0.由此可見，M.aeruginosa CHAB-109 的PSⅡ反應(yīng)中心電子受體側(cè)是WBL 的抑制作用位點之一.WBL 脅迫下TR0/RC、ET0/RC 均受到顯著抑制.由此可推測在反應(yīng)中心電子受體側(cè)電子由反應(yīng)中心傳遞到QA及QA后面的部位均為WBL 的抑制作用位點.

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