新生兒缺氧缺血性腦?。℉IE）是由圍生期窒息所致的嚴(yán)重新生兒疾病，心臟是常見的受累器官之一。利用超聲心動(dòng)圖對(duì)HIE患兒心功能進(jìn)行檢測(cè)可早期評(píng)價(jià)新生兒HIE并發(fā)心功能損害[1,2]，但針對(duì)心肌運(yùn)動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)和定量評(píng)價(jià)的研究較少。二維斑點(diǎn)追蹤成像（STI）技術(shù)能夠通過測(cè)量心肌在各個(gè)運(yùn)動(dòng)方向的應(yīng)變來反映和評(píng)價(jià)整體及局部心肌真實(shí)的運(yùn)動(dòng)情況和功能狀態(tài)[3]。本研究在新生豬HIE模型的基礎(chǔ)上，利用STI技術(shù)測(cè)量心肌圓周應(yīng)變及圓周應(yīng)變率（SrC），以期了解缺氧缺血性心肌損傷后心肌圓周運(yùn)動(dòng)的變化，觀察心肌組織的病理改變，為研究新生兒HIE合并心肌損傷提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立 新生3～5 d健康雄性約克豬18只，體重2～2.5 kg，隨機(jī)抽簽分為對(duì)照組（n=8）和模型組（n=10）。模型組：溫度保持在28～30℃，于無菌條件下行腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉、氣管插管（φ2.5 mm）、機(jī)械通氣（TKR-200C小動(dòng)物呼吸機(jī)）。經(jīng)頸旁正中切口鈍性剝離并阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈，同時(shí)機(jī)械通入6% O2與94% N2混合氣體30 min，監(jiān)測(cè)心率及血氧飽和度。造模結(jié)束后恢復(fù)雙側(cè)頸總動(dòng)脈血供，吸入40% O2，進(jìn)行縫合、包扎。對(duì)照組：手術(shù)過程同模型組，但不阻斷雙側(cè)頸總動(dòng)脈血流，機(jī)械通入40%O2。待意識(shí)恢復(fù)后撤掉呼吸機(jī)及氣管插管，置于恒溫箱中（設(shè)定溫度＞32℃），維持體溫38.5～39.5℃，以0.9%NaCl注射液5 ml/（kg?h）靜脈滴注補(bǔ)液，能進(jìn)食后每6小時(shí)給予奶粉30～60 ml。出現(xiàn)心率下降（＜100次/min）時(shí)，每次給予腎上腺素0.01 mg/kg靜脈注射，出現(xiàn)抽搐給予苯巴比妥鈉20 mg/kg靜脈注射，維持量5 mg/（kg?d）靜脈滴注，嚴(yán)重時(shí)呼吸機(jī)維持機(jī)械通氣（40% O2）[4]。1.2 超聲檢查 模型制備24 h后行超聲檢查。采用GE Vivid 7超聲顯像儀，7S探頭，探頭頻率2.5～6.0 MHz，麻醉后取左側(cè)臥位，連接同步導(dǎo)聯(lián)心電圖。于胸骨旁采集基底段、中間段和心尖段短軸二維動(dòng)態(tài)圖像，幀頻75～140幀/s，保存5個(gè)心動(dòng)周期，在EchoPAC工作站對(duì)圖像進(jìn)行脫機(jī)分析。選擇清晰圖像，定幀于收縮期末，手動(dòng)勾畫感興趣區(qū)（ROI），調(diào)整ROI至各節(jié)段追蹤滿意，獲得各節(jié)段心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率曲線。設(shè)定R波頂點(diǎn)為舒張期末，測(cè)量主動(dòng)脈瓣關(guān)閉時(shí)間確定收縮期末，心動(dòng)周期在兩個(gè)R波頂點(diǎn)之間。記錄各節(jié)段圓周應(yīng)變峰值（SC）、收縮期圓周應(yīng)變率峰值（SrC S）、舒張?jiān)缙趫A周應(yīng)變率峰值（SrC E）、舒張晚期圓周應(yīng)變率峰值（SrC A），計(jì)算基底段、中間段、心尖段及整體水平平均值，記錄心率。利用改良Simpson法[5]測(cè)量并計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。計(jì)算Tei指數(shù)[2]：二尖瓣環(huán)后間隔處組織多普勒頻譜Aa峰結(jié)束至Ea峰開始時(shí)間為A，Sa峰開始至結(jié)束時(shí)長(zhǎng)為B，Tei=（A―B）/B。

1.3 重復(fù)性檢驗(yàn) 隨機(jī)抽簽從對(duì)照組和模型組中各抽取4只豬，由2名相同資歷的檢查者按上述方法追蹤獲取各節(jié)段心肌圓周應(yīng)變曲線，計(jì)算整體水平SC；同一檢查者于不同時(shí)間對(duì)同一病例測(cè)量2次。比較檢查者間及檢查者內(nèi)的一致性。

1.4 病理檢查 超聲檢查結(jié)束后處死新生豬，用10%KCl 10 ml靜脈注射，取基底節(jié)區(qū)腦組織、左心室前乳頭肌及其旁室壁心肌組織用10%福爾馬林溶液固定，進(jìn)一步脫水包埋切片，腦組織切片行HE染色，心肌組織切片行HE染色及凋亡檢測(cè)（POD法，博士德MK1020）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0軟件，對(duì)照組與模型組間計(jì)量資料比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重復(fù)性檢驗(yàn)采用Bland-Altman分析，采用GraphPad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 模型組新生豬造模后皮膚、口鼻發(fā)紺，全身抽搐，四肢呈“劃槳樣”運(yùn)動(dòng)，頭部顫抖，頸強(qiáng)直；對(duì)照組未見明顯異常運(yùn)動(dòng)。兩組新生豬實(shí)驗(yàn)期間均未出現(xiàn)死亡。

2.2 兩組左心室心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率比較 模型組基底段、中間段、心尖段及整體水平SC、SrC S、SrC E、SrC A均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1、圖1。

2.3 兩組心率及心功能比較 模型組心率較對(duì)照組快，LVEF較對(duì)照組低，Tei指數(shù)較對(duì)照組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.4 重復(fù)性檢驗(yàn) Bland-Altman分析圖顯示，檢查者間及檢查者內(nèi)測(cè)值一致性均較高。

2.5 心肌組織凋亡檢測(cè)及病理檢查 對(duì)照組心肌組織切片胞核均藍(lán)染；模型組可見散在胞核呈金棕色（圖2）。對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，胞核清晰，細(xì)胞無腫脹；模型組心肌細(xì)胞腫脹，排列紊亂，部分胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)空泡，部分胞核腫脹、淡染，核膜、核仁顯示不清（圖3）。對(duì)照組神經(jīng)元胞質(zhì)豐富，核清晰可見，核仁清楚；模型組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫脹，神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)淡染、出現(xiàn)空泡，部分神經(jīng)元細(xì)胞膜破壞，胞核腫脹、淡染，核膜、核仁顯示不清（圖4）。

表1 新生豬HIE模型組與對(duì)照組各水平圓周應(yīng)變峰值及圓周應(yīng)變率比較

圖1 對(duì)照組（A）與模型組（B）中間段短軸圓周應(yīng)變曲線，與對(duì)照組比較，模型組中間段短軸各節(jié)段應(yīng)變峰值減低，曲線形態(tài)低平、不規(guī)整

圖2 心肌凋亡檢測(cè)。模型組（B）可見凋亡心肌細(xì)胞胞核（箭），而對(duì)照組（A）胞核均勻藍(lán)染（HE, ×400）

圖3 心肌組織病理示模型組（B）心肌細(xì)胞胞核不清（箭），而對(duì)照組（A）胞核清晰（HE, ×400）

圖4 腦組織病理示模型組（B）基底節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)空泡（箭），胞核不清（箭頭），而對(duì)照組（A）胞質(zhì)豐富，胞核清晰（HE, ×400）

表2 新生豬HIE模型組與對(duì)照組心率及心功能指標(biāo)比較

3 討論

新生豬與新生兒的體型大小及生長(zhǎng)發(fā)育等較為相近，通過暫時(shí)性全腦缺血加機(jī)械低氧通氣建立新生豬HIE模型的實(shí)驗(yàn)方法，缺氧條件穩(wěn)定，重復(fù)性良好，對(duì)新生兒HIE模擬結(jié)果較可靠[4]。本實(shí)驗(yàn)中模型組新生豬腦組織細(xì)胞變性，部分可見壞死，證實(shí)造模成功。

HIE造成心肌損傷的機(jī)制為：①缺氧后無氧酵解增加，引起細(xì)胞內(nèi)酸中毒；ATP生成障礙引起細(xì)胞膜離子泵功能受損；線粒體損傷與細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致鈣依賴性酶的激活；上述原因?qū)е履ち字到狻⒌鞍踪|(zhì)分解甚至DNA水解，造成組織細(xì)胞變性、壞死、凋亡等[6,7]。②腦損傷造成繼發(fā)性心肌損傷，包括兒茶酚胺合成增多、交感與副交感神經(jīng)支配失衡以及肽能神經(jīng)作用等，可以加重心肌缺氧缺血，引起心律紊亂及心血管反射調(diào)節(jié)紊亂等[8]。本實(shí)驗(yàn)中模型組心肌組織內(nèi)可檢測(cè)到散在的凋亡細(xì)胞，而對(duì)照組則無凋亡發(fā)生；既往研究[9]曾報(bào)道模型組心肌HE染色結(jié)果，但凋亡檢測(cè)情況鮮有報(bào)道。

模型組LVEF低于對(duì)照組，Tei指數(shù)高于對(duì)照組，均表明造模后左心室功能下降。既往利用超聲心動(dòng)圖技術(shù)對(duì)早期評(píng)價(jià)新生兒HIE并發(fā)心功能損害有一定意義[1,2]，如LVEF能反映左心室整體泵血功能下降，Tei指數(shù)能反映左心室整體功能降低，M型超聲能夠發(fā)現(xiàn)室壁運(yùn)動(dòng)幅度及左心室短軸縮短率降低。心肌應(yīng)變及應(yīng)變率能夠同時(shí)反映局部及整體心肌在各個(gè)方向的運(yùn)動(dòng)，可進(jìn)一步觀察HIE合并心肌損傷所致的心肌運(yùn)動(dòng)異常。心肌應(yīng)變指心肌在心動(dòng)周期中由心肌纖維的收縮和舒張運(yùn)動(dòng)所引起的形變，反映心肌的機(jī)械特性，心肌整體和各節(jié)段的應(yīng)變值可以用來評(píng)價(jià)相應(yīng)的心肌功能。STI技術(shù)利用軟件對(duì)心肌組織內(nèi)部回聲斑點(diǎn)的空間運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤識(shí)別，跟蹤其在每一幀圖像中的位置，描記其在心動(dòng)周期中的運(yùn)動(dòng)軌跡，以此來計(jì)算心肌運(yùn)動(dòng)多項(xiàng)參數(shù)，分析心肌運(yùn)動(dòng)的力學(xué)特征；同時(shí)克服了聲束方向、角度及取樣位置等的限制，能夠從縱向、徑向、圓周等方向?qū)π募∵\(yùn)動(dòng)進(jìn)行研究，定性、定量地反映心肌運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和功能[3]。

模型組左心室基底段、中間段、心尖段及整體水平心肌圓周應(yīng)變峰值及各時(shí)相應(yīng)變率峰值均較對(duì)照組明顯減低，心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率曲線較對(duì)照組低平，說明造模后各節(jié)段心肌組織圓周方向收縮、舒張運(yùn)動(dòng)均受到損傷。圓周運(yùn)動(dòng)是心肌短軸方向的環(huán)形運(yùn)動(dòng)，其應(yīng)變值反映了室壁在心動(dòng)周期中環(huán)形的縮短與伸長(zhǎng)的程度，是左心室心肌一種較為重要的運(yùn)動(dòng)方式。Yan等[10]研究顯示，在射血分?jǐn)?shù)保留（LVEF＞45%）的冠狀動(dòng)脈疾病患者中，存在碎片狀QRS波（fQRS）的患者與非fQRS患者相比，各水平圓周應(yīng)變明顯減低，整體水平圓周應(yīng)變降低是fQRS的危險(xiǎn)因素，能夠預(yù)測(cè)心臟不良事件。王其海等[11]研究發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈不同程度狹窄患者相關(guān)節(jié)段圓周應(yīng)變較正常對(duì)照組減低，其圓周應(yīng)變峰值絕對(duì)值與冠狀動(dòng)脈狹窄程度呈負(fù)相關(guān)。

造模后24 h，新生豬心肌損傷表現(xiàn)為細(xì)胞變性，偶見點(diǎn)灶狀壞死，并出現(xiàn)散在的心肌細(xì)胞凋亡。在心肌細(xì)胞損傷的基礎(chǔ)上，左心室心肌收縮期與舒張期圓周運(yùn)動(dòng)均明顯減弱，說明HIE合并心肌損傷時(shí)圓周方向環(huán)形肌纖維受累，而心肌圓周應(yīng)變及應(yīng)變率檢測(cè)可以早期評(píng)價(jià)新生兒HIE合并心肌損傷。由于心肌細(xì)胞是不可再生細(xì)胞，未來若能建立局部心肌細(xì)胞壞死、凋亡程度與相應(yīng)節(jié)段應(yīng)變及應(yīng)變率峰值的關(guān)系，將對(duì)新生兒HIE合并心肌損傷的預(yù)后有重要臨床意義。

由于STI技術(shù)易受到圖像質(zhì)量的制約而產(chǎn)生追蹤和測(cè)量誤差。本研究中使用的7S探頭常用于嬰幼兒檢查，不是專用的動(dòng)物探頭，但7S探頭分辨力尚好，3～5 d新生豬與同日齡新生兒軀干部分大小相似，心臟體積接近，且胸壁較薄，圖像質(zhì)量尚好。造模后心率加快，需要及時(shí)增加幀頻，當(dāng)直接調(diào)節(jié)到極限時(shí)，需要犧牲圖像寬度和深度來進(jìn)一步增加幀頻，確保曲線質(zhì)量。通過抽樣進(jìn)行的重復(fù)性檢驗(yàn)顯示，本研究中數(shù)據(jù)測(cè)量在檢查者間及檢查者內(nèi)一致性均較好。

總之，利用新生豬HIE模型能夠復(fù)制新生兒HIE合并心肌損傷，通過STI技術(shù)檢測(cè)圓周應(yīng)變及應(yīng)變率能夠早期評(píng)價(jià)新生豬HIE的心肌損傷情況，可以為新生兒HIE合并心肌損傷的研究提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為新生兒窒息后多器官缺氧缺血性損傷的深入研究提供可靠的動(dòng)物模型。

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