栗大超，王日東，劉 宇，徐可欣

基于微透析的組織液中葡萄糖濃度連續(xù)檢測方法

栗大超，王日東，劉 宇，徐可欣

(天津大學精密儀器與光電子工程學院，天津 300072)

基于微創(chuàng)血糖檢測中需要對組織液中葡萄糖濃度進行校準的要求，提出了一種利用微透析連續(xù)檢測組織液中葡萄糖濃度的方法，研究了灌流速度、被測液濃度和溫度等條件對回收率的影響．實驗結(jié)果表明，灌流速度從0.3,μL/min上升到3.0,μL/min時，回收率下降71.7%；組織液濃度變化對回收率沒有明顯影響，溫度從25,℃上升到58,℃時，回收率則上升34.6% ．此外，提出了一種模擬體內(nèi)葡萄糖濃度連續(xù)變化的方法，并建立了實驗系統(tǒng)，驗證了微透析方法在葡萄糖濃度連續(xù)變化條件下用于組織液葡萄糖檢測的可行性．為進一步開展動物實驗提供了理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)．

組織液；葡萄糖；微透析；連續(xù)檢測；校準

糖尿病是一種嚴重危害人類健康的疾病，連續(xù)血糖檢測在臨床上有著十分重要的意義．目前根據(jù)檢測方法對人體的損傷程度，血糖濃度檢測方法可以分為3類：有創(chuàng)檢測、無創(chuàng)檢測和微創(chuàng)檢測．有創(chuàng)血糖檢測技術(shù)無法避免對患者的創(chuàng)傷，很難實現(xiàn)連續(xù)檢測；無創(chuàng)血糖檢測方法依靠光與人體特定部位組織的相互作用來檢測人體內(nèi)血糖濃度的變化[1]，由于生物個體差異性大、信號提取困難以及生理和測量條件難以控制等因素的制約，目前還處于研究階段[2]；微創(chuàng)血糖濃度檢測技術(shù)是通過將傳感器植入皮下或通過組織液透皮抽取的方法來測量人體組織液中葡萄糖濃度[3]，再根據(jù)組織液中葡萄糖濃度與血液中葡萄糖濃度的關(guān)系得到血液中葡萄糖濃度．微創(chuàng)血糖濃度檢測在最大限度地降低對人體造成創(chuàng)傷的基礎(chǔ)上，可實現(xiàn)人體血糖濃度的動態(tài)、連續(xù)監(jiān)測，技術(shù)原理相對簡單，具有可實現(xiàn)性更強、使用方便、響應(yīng)時間短等特點，能滿足糖尿病人血糖濃度檢測的臨床需要，具有重要的應(yīng)用價值和商業(yè)前景[4]．

目前利用微創(chuàng)血糖檢測技術(shù)檢測組織液葡萄糖濃度主要有2種方法：①將組織液透皮抽取到體外進行檢測；②在皮下植入傳感器直接檢測組織液濃度[5].前者由于抽取的組織液量很小，往往需要經(jīng)過稀釋才有利于收集和測量，測得的不是組織液葡萄糖濃度的真實值；后者則受到體內(nèi)生物電或化學物質(zhì)的干擾，測得結(jié)果也不是真實的組織液濃度值．這2種方法都需要用組織液中葡萄糖濃度的真實值來校準．目前如何獲得這一真實值是一個世界性難題．筆者探索性地提出一種基于微透析的組織液葡萄糖檢測方法，實現(xiàn)組織液中葡萄糖濃度的連續(xù)檢測，為微創(chuàng)血糖檢測的校準供校所需的組織液中葡萄糖濃度的真實值．

1 組織液中葡萄糖濃度的檢測方法

采用微透析(microdialysis)技術(shù)檢測組織液中的葡萄糖濃度，對插入皮下組織的微透析探針在非平衡條件下進行灌流，葡萄糖分子沿濃度梯度逆向擴散，穿過探針尾部的半透膜進入透析管內(nèi)，并被透析管內(nèi)流動的灌流液不斷帶出，最后對流出的透析液進行檢測，進而得到組織液中葡萄糖的濃度值．這種檢測方法具有連續(xù)性強、取樣量小、組織創(chuàng)傷小等優(yōu)點．

微透析是一種被動的擴散過程，可用Fick’s第一擴散定律[6]來表示，即

式中：J為單位時間內(nèi)穿過半透膜的物質(zhì)的分子數(shù)；D為擴散系數(shù)；A為半透膜的表面積；C為待測物質(zhì)的濃度；dC/dx為半透膜內(nèi)外的濃度梯度；負號表示物質(zhì)擴散的方向與濃度增加的方向相反．

式(1)表明，在單位時間內(nèi)通過垂直于擴散方向的單位截面的葡萄糖相對分子質(zhì)量與該截面處的濃度梯度，以及實驗所選用的微透析探針半透膜表面積成正比，與探針的曲率成反比．

由于微透析是在非平衡取樣條件下取樣，所以測得透析液中葡萄糖的濃度只是探針周圍組織液中葡萄糖濃度的一部分[7]，前者與后者的比值稱為探針的回收率[8-9]，即

式中：R表示回收率；cout和cq分別表示透析液和周圍組織液中葡萄糖的量濃度，mmol/L．

相關(guān)書籍和研究文獻也對微透析的過程提出了更為詳細的數(shù)學模型，如Bungay等[10]提出的模型

式中：Rd、Rm、Re分別表示透析液、探針半透膜、外部介質(zhì)的擴散阻力；Q為微透析灌流速度. 式(3)表明，隨著灌流速度增大，回收率呈指數(shù)下降趨勢．

2 影響組織液中葡萄糖濃度檢測的因素

搭建了一套體外微透析模擬實驗系統(tǒng)，通過配制不同濃度的葡萄糖溶液來對微透析的檢測方法進行研究，分別研究了灌流速度、葡萄糖溶液的濃度、溫度等主要因素對回收率大小的影響．在此基礎(chǔ)上建立了模擬體內(nèi)葡萄糖濃度連續(xù)變化的實驗系統(tǒng)，為進一步開展基于微透析的葡萄糖濃度檢測的動物實驗奠定了基礎(chǔ)．

2.1 體外微透析模擬實驗系統(tǒng)

體外微透析模擬實驗系統(tǒng)主要是由微量注射泵、微透析探針、恒溫水浴池和酶電極傳感器組成．微量注射泵的功能是向微透析探針注射灌流液(0.9%NaCl溶液)，恒溫水浴池用來調(diào)節(jié)葡萄糖溶液的溫度，酶電極傳感器的作用是檢測透析液中的葡萄糖濃度．實驗所選用的探針是瑞典CMA公司的CMA20 microdialysis probe(CMA Microdialysis，Sweden)，分子截留量為20,kD，膜長為10,mm，透析膜直徑0.5,mm．

系統(tǒng)的工作過程如圖1所示，灌流液由注射泵注入微透析探針的輸入端，在探針尾部通過半透膜與葡萄糖溶液發(fā)生物質(zhì)交換，最后經(jīng)探針輸出端流出，并由檢測器測量透析液中的葡萄糖濃度．實驗中通過改變灌流速度、溫度、葡萄糖溶液濃度等條件，研究其對回收率的影響．

圖1 體外微透析實驗系統(tǒng)Fig.1 Experiment system of microdialysis in vitro

2.2 灌流速度對回收率的影響

灌流速度分別選用0.3,μL/min、0.5,μL/min、1.0,μL/min、1.5,μL/min、2.0,μL/min和3.0,μL/min，待測葡萄糖溶液濃度為5.3,mmol/L，環(huán)境溫度為26,℃.由于探針的輸出管路的體積為6,μL，分別以0.3,μL/min、1.0,μL/min、1.5,μL/min、2.0,μL/min、2.5,μL/min、3.0,μL/min和5.0,μL/min的流速進行灌流時，微透析達到平衡所需的時間分別約為20,min、6,min、4,min、3,min、2.4,min、2,min和1.2,min．達到平衡后，每5,min收集一次透析液進行測量．由此得到灌流速度與回收率的對應(yīng)關(guān)系如圖2所示，縱軸為葡萄糖溶液在不同灌流速度下進行微透析對應(yīng)的平均回收率，每個數(shù)據(jù)點取8次測量的平均值．從圖2中可以看出，隨著灌流速度的增大，對應(yīng)的回收率呈指數(shù)趨勢不斷減小．當灌流速度大于1.0,μL/min時，回收率較低，這就對傳感器在低葡萄糖濃度環(huán)境下的測量提出了較高的要求．若流速低于0.5,μL/min，透析液收集速度較慢，會造成組織液檢測的實時性下降．

圖2 灌流速度對回收率的影響Fig.2 Effect of perfusion rate on recovery rate

2.3 葡萄糖濃度對回收率的影響

分別選取濃度為3.1,mmol/L、5.3,mmol/L、8.2,mmol/L和10.3,mmol/L的葡萄糖溶液，灌流速度設(shè)定為1.0,μL/min，溫度為26,℃．微透析達到平衡后，每5,min收集一次透析液進行測量，得到葡萄糖濃度與回收率的對應(yīng)關(guān)系如圖3所示．

圖3 葡萄糖濃度對回收率的影響Fig.3 Effect of glucose concentration on recovery rate

可以看出曲線基本與橫軸平行，表明在灌流速度與溫度恒定的條件下，葡萄糖溶液的濃度對回收率無明顯影響．這一結(jié)果說明在其他條件穩(wěn)定的情況下，對不同濃度的葡萄糖溶液進行微透析可以得到穩(wěn)定的回收率，即微透析可以用于透析液濃度動態(tài)實時變化條件下的連續(xù)檢測．

2.4 溫度對回收率的影響

灌流速度設(shè)定為1.0,μL/min，葡萄糖溶液濃度為5.3,mmol/L，通過水浴池調(diào)節(jié)溫度的變化范圍為20～60,℃．每改變一次水浴溫度，當待測葡萄糖溶液的溫度與水浴溫度平衡后再進行透析．由此得到溫度與回收率的對應(yīng)關(guān)系如圖4所示．

實驗中測得溶液溫度分別為25,℃、31,℃、36,℃、42,℃、49,℃和58,℃．由圖4可知，回收率隨溫度上升而明顯增大，二者具有較好的線性相關(guān)性．此結(jié)果說明，用微透析的方法檢測組織液的葡萄糖濃度應(yīng)保持被測部位溫度恒定，以獲得穩(wěn)定的回收率，實現(xiàn)有效校正．

圖4 溫度對回收率的影響Fig.4 Effect of temperature on recovery rate

3 體內(nèi)葡萄糖濃度連續(xù)變化的模擬實現(xiàn)

在實際應(yīng)用中，隨著人體正常生理活動的進行，組織液中的葡萄糖濃度會發(fā)生連續(xù)變化．為此提出了一種模擬人體內(nèi)組織液中葡萄糖濃度連續(xù)變化的方法，并搭建了實驗系統(tǒng)，為開展基于微透析的葡萄糖濃度檢測的動物實驗奠定了基礎(chǔ)．

3.1 系統(tǒng)組成

體內(nèi)葡萄糖濃度連續(xù)變化的模擬實驗系統(tǒng)如圖5所示．該系統(tǒng)由注射泵、微透析探針、蠕動泵、混合腔、通道閥和葡萄糖傳感器等器件組成．2臺蠕動泵分別用于抽取葡萄糖溶液和緩沖液，使2種液體進入混合腔內(nèi)，經(jīng)過充分混合后由輸送管輸出．實驗中通過調(diào)節(jié)2個蠕動泵的抽取速率來改變混合液中的葡萄糖濃度，并使它們的抽取速率之和保持恒定，以免混合液流速的變化對微透析的回收率產(chǎn)生影響．二選一閥門的作用是切換混合液流出的通道，實現(xiàn)透析液濃度和透析前混合液濃度的獨立檢測．

圖5 模擬葡萄糖濃度連續(xù)變化的系統(tǒng)Fig.5 System for simulating continuous glucose concentration change

3.2 體內(nèi)葡萄糖濃度連續(xù)變化的模擬檢測結(jié)果

將緩沖液(0.9% NaCl溶液)與葡萄糖溶液(10.3,mmol/L)以3,mL/min的總流速按不同的比例進行混合，調(diào)整2個蠕動泵的抽取速率以改變混合液中葡萄糖的濃度，使其在0～10.3,mmol/L之間變化．

首先檢測混合溶液濃度穩(wěn)定所需時間．調(diào)整兩個蠕動泵流速為2,007,μL/min和1,004,μL/min，濃度穩(wěn)定后第1次將速度分別調(diào)為1,493,μL/min、1,520,μL/min，此時記為零時刻，然后在0.5,min、1.0,min、1.5,min、2.0,min、2.5,min、3.0,min、3.5,min、4.0,min、5.0,min、6.0,min、7.0,min、8.0,min、9.0,min和10.0,min時取樣．在10,min、20,min和30,min時分別調(diào)整蠕動泵流速，并按照上述的時間間隔取樣．測量結(jié)果如圖6所示，可以看出蠕動泵流速發(fā)生變化時，混合液濃度會迅速發(fā)生變化，2,min后即可達到穩(wěn)定狀態(tài)．

圖6 混合液濃度與混合時間的關(guān)系Fig.6 Relationship between mixture concentration and time

之后，對濃度連續(xù)變化的溶液進行微透析取樣檢測，灌流速度選擇1.0,μL/min，溫度為20,℃，混合溶液流速3,mL/min．考慮到微透析探針的延時以及葡萄糖溶液和緩沖液混合均勻所需的時間，確定在調(diào)整蠕動泵流速后的8,min時測量透析液濃度，隨即對透析前的混合液取樣并檢測．透析液與透析前的混合液的獨立取樣通過切換二通閥實現(xiàn)，按照調(diào)速→透析液取樣→切換通道→透析前的混合液取樣這樣的順序進行．上述過程共進行7次．

如圖7所示，帶有方形標記的是不同濃度下多次測量的平均值，以此來得到擬合的直線．之后又按照同樣的步驟測量16次，用圖7中擬合曲線的方程校正透析液濃度值，可得到濃度校正曲線，如圖8所示，帶有菱形標志的是透析前的混合液濃度曲線，濃度變化經(jīng)歷了2個由高到低再升高的過程；帶有三角形標志的是校正后透析液濃度曲線，校正曲線上的對應(yīng)點與混合液濃度非常接近．校正后的值與實際測得對應(yīng)點的濃度值相比，誤差小于5%的概率為43.75%，誤差在5%～10%之間的概率為50.00%，誤差大于10%的概率僅為6.25%．

圖7 混合液濃度與透析液濃度的關(guān)系Fig.7 Concentration relationship between mixture and dialysate

圖8 微透析測量的校正Fig.8 Microdialysis calibration

4 結(jié) 論

(1) 灌流速度對微透析探針的回收率影響顯著，選擇1.0,μL/min時回收率可以滿足實際需求．

(2) 濃度對回收率無明顯影響．

(3) 溫度上升使得回收率不斷增大，應(yīng)維持檢測部位的溫度恒定．

(4) 實驗結(jié)果具有較好的重復性．

在此基礎(chǔ)上，提出了一種模擬人體組織液葡萄糖濃度連續(xù)變化的方法，并搭建了實驗系統(tǒng)，驗證了微透析用于體內(nèi)濃度連續(xù)變化條件下的可行性，所得數(shù)據(jù)表明校正后濃度值與混合液測得值之間誤差小于10%的概率為93.75%．此研究取得的成果為下一步開展動物實驗奠定了基礎(chǔ)．

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A Method for Continuous Glucose Monitoring in Interstitial Fluid Based on Microdialysis

Li Dachao，Wang Ridong，Liu Yu，Xu Kexin
(School of Precision Instrument and Opto-Electronics Engineering，Tianjin University，Tianjin 300072，China)

A method based on microdialysis was presented to monitor glucose concentration in interstitial fluid to meet the requirement that the glucose concentration in interstitial fluid should be calibrated in minimally invasive blood glucose monitoring, and the influences of perfusion rate, concentration and temperature on the recovery rate of microdialysis were studied. The results led to the conclusion that the recovery rate fell by 71.7% when perfusion rate increased from 0.3 μL/min to 3.0 μL/min, different concentrations of interstitial fluid contributed little to the recovery rate, and the rise of temperature from 25 ℃ to 58 ℃ caused the recovery rate to increase by 34.6%. In addition, a method for simulating the rapid changes in glucose concentration in vivo was proposed, and the experimental system was established to verify the feasibility of continuous measurement of glucose level in interstitial fluid by microdialysis. All the work laid a theoretic foundation and experimental guidance for animal clinical trials in the future.

interstitial fluid；glucose；microdialysis；continuous monitoring；calibration

TH776

A

0493-2137(2013)06-0482-05

DOI 10.11784/tdxb20130602

2012-09-16；

2012-12-16.

國家自然科學基金資助項目(61176107)；國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)資助項目(2012AA022602)；天津市科技支撐計劃重點基金資助項目(11ZCKFSY01500).

栗大超（1976—），男，博士，副教授.通訊作者：栗大超，dchli@tju.edu.cn.