馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍
(北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)
一種吡蟲啉的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)試劑盒的研制
馬寅生 馮才偉 賈芳芳 馮 靜 楊 爍
(北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京 昌平 102206)
本文利用酶聯(lián)免疫技術(shù)研制了一種快速檢測(cè)吡蟲啉殘留的試劑盒,經(jīng)過測(cè)試,該試劑盒對(duì)蔬菜、水果樣本的檢測(cè)限為20μg/kg,批內(nèi)、批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。本研究的吡蟲啉ELISA檢測(cè)試劑盒能夠應(yīng)用于大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè),使用簡(jiǎn)便,結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
吡蟲啉 酶聯(lián)免疫試劑盒 蔬菜 水果 快速檢測(cè)
吡蟲啉(IMI)是煙堿類殺蟲劑,具有廣譜、高效,害蟲不易產(chǎn)生抗性,對(duì)人、畜、植物和天敵安全等特點(diǎn),主要用于防治刺吸式口器害蟲及其抗性品系[1,2]。目前,含IMI的農(nóng)藥產(chǎn)品已在120多個(gè)國家的140余種農(nóng)作物上登記使用,應(yīng)用范圍涉及糧食、經(jīng)濟(jì)、果樹、茶葉和蔬菜等[3]。然而,IMI的大量使用對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重影響,同時(shí)畜禽因長期食用含IMI殘留的植物,使其在體內(nèi)富集,最后經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體,危害人體健康。
從文獻(xiàn)報(bào)道看,有關(guān)吡蟲啉殘留的檢測(cè)方法主要集中于高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)4個(gè)方面。通過比較儀器法和快檢方法在我國實(shí)際檢測(cè)中所起到的作用,本研究著重建立一種檢測(cè)蔬菜、水果樣本中吡蟲啉的酶聯(lián)免疫吸附法,該方法的準(zhǔn)確性高于一般的快速檢測(cè)方法,檢測(cè)程序及所需條件較儀器法更方便,尤其便于現(xiàn)場(chǎng)大量樣本的檢測(cè),更適于中小企業(yè)對(duì)成本控制的需求。
1.1 材料與儀器
吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心,二甲基甲酰胺、牛血清白蛋白、碳酸鹽、戊二醛、卵清蛋白、硼氫化鈉等均購自北京百欣試劑公司,蔬菜、水果購自超市,酶標(biāo)儀購自上海雷勃分析儀器有限公司,渦旋儀、均質(zhì)器購自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。
1.2 方法
1.2.1 吡蟲啉半抗原的制備 100ml二口瓶中加入吡蟲啉0.25g,二甲基甲酰胺(DMF)1ml,水合氯化錫0.75g和乙醇10ml,氮?dú)馀趴?,控?5℃反應(yīng)40min,反應(yīng)液顯褐色,薄層色譜(TLC)檢測(cè)反應(yīng)完全。處理:降溫至室溫,加乙酸乙酯50ml,加飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)節(jié)至弱堿性,大量鹽析出,乙酸乙酯40ml×2次萃取渾濁液,合并有機(jī)相,鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,蒸干溶劑,得固體產(chǎn)物0.22g。
圖1 吡蟲啉半抗原合成路線圖
1.2.2 抗原的制備 (1)免疫原制備—吡蟲啉半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原,溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取牛血清白蛋白(BSA)30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L碳酸鹽緩沖液(CB)(pH 9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4g,用0.01mol/L磷酸緩沖液(PBS) 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。(2)包被原制備—吡蟲啉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)得到免疫原。取7mg半抗原溶解于1ml DMF中;取0.1ml戊二醛水溶液加入半抗原溶液中,室溫下攪拌24h,即可得到反應(yīng)液A;稱取OVA 30mg,使之充分溶解在2.7ml 0.1mol/L CB(pH9.6)中,將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中,并于室溫下攪拌24h,用0.2ml 5mol/L的硼氫化鈉水溶液還原反應(yīng)4h,用0.01mol/L PBS 4℃透析3d,每天換3次透析液,以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。
1.2.3 酶標(biāo)板的制備 吡蟲啉單克隆抗體及羊抗鼠抗抗體制備完成后,進(jìn)行酶標(biāo)板的制備。用包被緩沖液將包被原稀釋成20μg/ml,每孔加入100μl,37℃避光孵育2h,傾去孔中液體,用洗滌液洗滌2次,每次30s,拍干,然后在每孔中加入200μl封閉液,37℃避光孵育2h,傾去孔內(nèi)液體拍干,干燥后用鋁膜真空密封保存。
1.2.4 試劑盒靈敏度和檢測(cè)限試驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)曲線0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度值50%處所對(duì)應(yīng)的藥物濃度(IC50)來評(píng)價(jià)試劑盒的靈敏度。分別對(duì)20份蔬菜、水果空白樣品進(jìn)行檢測(cè),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測(cè)限。
1.2.5 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn) 以回收率作為準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)指標(biāo),重復(fù)測(cè)定某一濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)作為精密度評(píng)價(jià)指標(biāo)。計(jì)算公式為:回收率(%)=實(shí)際測(cè)定值/理論值×100%,其中理論值為樣品的添加濃度;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD%=SD/X×100%,其中SD為標(biāo)準(zhǔn)偏差,X為測(cè)定數(shù)據(jù)的平均值。按100μg/kg、300μg/kg、500μg/kg三個(gè)濃度吡蟲啉分別對(duì)蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加回收測(cè)定,每個(gè)樣品做4個(gè)平行,用三批不同試劑進(jìn)行測(cè)定,計(jì)算樣品的平均回收率及精密度。
2.1 半抗原合成鑒定結(jié)果
用核磁共振氫譜測(cè)定制備好的吡蟲啉半抗原,如圖2所示,4.7ppm左右的峰為咪唑啉環(huán)上的兩個(gè)亞甲基信號(hào)峰,5.0ppm左右的峰為芐基信號(hào)峰,7.2-8.7ppm為氨基與芳環(huán)混合信號(hào)峰,說明目標(biāo)半抗原合成成功。
圖2 吡蟲啉半抗原核磁共振氫譜圖
2.2 試劑盒靈敏度和檢測(cè)限
按照常規(guī)方法測(cè)定試劑盒靈敏度,試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)為4μg/kg,標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為4~324μg/kg,IC50(50%抑制濃度)為12.9μg/kg;對(duì)20份樣品進(jìn)行檢測(cè),從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)于各百分吸光度值的濃度,以20份樣本濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測(cè)限,結(jié)果得該方法對(duì)樣本的檢測(cè)限為20μg/kg。見圖3。
圖3 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.3 樣本精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)
以100、300、500μg/kg三個(gè)濃度的吡蟲啉分別對(duì)蔬菜和水果樣品進(jìn)行添加,平均回收率在83.5%~117.9%之間;批內(nèi)、批間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。見表1、2。
表1 蔬菜精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) (μg/kg、%)
表2 水果精密度及準(zhǔn)確度試驗(yàn) (μg/kg、%)
目前,高效液相色譜法(HPLC)、氣相色譜法(GC)、電化學(xué)分析法(EA)和免疫分析法(ELISA)是檢測(cè)吡蟲啉殘留的主要方法。Placke and Weber曾經(jīng)報(bào)道了運(yùn)用HPLCUVD研究了IMI在植物中的殘留量[4]。IshiiY等也采用HPLC-UVD檢測(cè)技術(shù)研究了IMI在部分作物和土壤中的殘留動(dòng)態(tài)[5]。Fermandz Alba A R等用HPLC-DAD測(cè)定蔬菜中IMI殘留量[6]。Erenchun N R等還采用HPLC-PRAD測(cè)定了土壤中的殘留IMI及其主要降解物含量[7]。Fernadez Alba A R等應(yīng)用HPLC-MS技術(shù)檢測(cè)蔬菜中IMI殘留量,得到了小于1.0 mg/kg的檢出限[8]。有關(guān)IMI殘留GC測(cè)定方法主要集中在GC-MS聯(lián)用技術(shù)上,如NavalonA.等運(yùn)用GC-MS測(cè)定蔬菜中IMI的殘留量,得到了1.25~25mg/kg的線性檢測(cè)范圍和2.5mg/kg的檢測(cè)限[9]。IMI殘留的電化學(xué)分析方法報(bào)道較少,且其線性檢測(cè)范圍,檢測(cè)限均不及色譜法。在IMI殘留的免疫檢測(cè)方法方面,Jae Koo Lee等報(bào)道了通過制備IMI-pAb,采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)蘋果和水中的IMI殘留,其檢測(cè)限為5.0μg/L[10]。Zhixiong Li等報(bào)道了基于抗IMI多克隆抗體(IMI-pAb)的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA,檢測(cè)限是30ng/ml[11]。國內(nèi),鄭尊濤等報(bào)道了IMI的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法,最低檢測(cè)限為1.2μg/L,該研究的下一步計(jì)劃是研發(fā)試劑盒[12]。朱國念等在2005年制備了吡蟲啉多克隆抗體,利用酶聯(lián)免疫反應(yīng)測(cè)定其檢測(cè)限為1.1 μg/L[13]。本研究的吡蟲啉ELISA快速檢測(cè)試劑盒比起高效液相色譜法、氣相色譜法以及電化學(xué)分析法更為簡(jiǎn)便;該試劑盒對(duì)蔬菜、水果樣本的檢測(cè)限為20μg/kg,雖然比起上述文獻(xiàn)中的同類方法較高,但是此類文獻(xiàn)并未開發(fā)出試劑盒,實(shí)際應(yīng)用性有待加強(qiáng);同時(shí)該試劑盒的操作時(shí)間僅需1.5h,即具有更適宜現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。
目前,色譜法是公認(rèn)的藥物殘留檢測(cè)方法,但這類方法普遍存在著所需儀器昂貴、操作技術(shù)要求高、樣品前處理繁瑣和分析耗時(shí)長、檢測(cè)成本高、不適于現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)等問題。而藥物殘留免疫檢測(cè)技術(shù)在殘留樣本檢測(cè)過程中的復(fù)雜程度、速度、靈敏度、準(zhǔn)確性、特異性、單位時(shí)間內(nèi)樣本分析容量、檢測(cè)成本等方面與儀器分析法的比較優(yōu)勢(shì)突出,幾乎克服了儀器分析法所表現(xiàn)出來的所有不足,近年來已經(jīng)在食品質(zhì)量安全檢測(cè)中得到了越來越廣泛的應(yīng)用,逐漸被人們認(rèn)可。
今天,人們對(duì)農(nóng)產(chǎn)品安全呼聲日益提高,農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的有效檢測(cè)手段致關(guān)重要。國際上對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉最大殘留量的規(guī)定日益嚴(yán)格,為更好地適應(yīng)進(jìn)出口貿(mào)易和保護(hù)人民的健康,開發(fā)農(nóng)產(chǎn)品中IMI的殘留快速檢測(cè)技術(shù)勢(shì)在必行。免疫學(xué)方法是當(dāng)前藥物殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。如何使殘留樣本前處理程序更加簡(jiǎn)單、靈敏度更高、成本更低廉,是擺在我們面前亟待解決的重要問題。
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S859.83
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1007-1733(2013)05-0006-03
2013–04–15)