徐 曉 歐陽衛(wèi)澤 鄭美蓉，2

(1 九江學院臨床醫(yī)學院/附屬醫(yī)院; 2 九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 江西九江 332000)

彌漫性大B 細胞淋巴瘤(diffuse large B -cell lymphoma，DLBCL)是最常見的一類非霍奇金淋巴瘤，在臨床特征、形態(tài)學表現(xiàn)、免疫表型和分子遺傳學等方面具有異質(zhì)性［1］。MicroRNA 是近來發(fā)現(xiàn)的一類調(diào)節(jié)基因表達的非編碼RNA。成熟miRNA 大約19 -25nt (核苷酸)，由70 -100nt(核苷酸)pre-miRNA 剪切而來，成熟miRNA 通過和靶基因mRNA 堿基配對引導沉默復合體(RNA - induced silencing complex，RISC)降解mRNA 或阻礙其翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達［2］。miR -15a、miR -16 -1 屬于MicroRNA的兩個成員。2002年，Calin 等發(fā)現(xiàn)miR -15a和miR-16 -1 定位于人染色體13q14.3的區(qū)域內(nèi)，而這一區(qū)域在50%的慢性淋巴細胞白血病(CLL)病人中缺失［2］。Cimmino 等研究發(fā)現(xiàn)miR-15a 和miR -16 -1 兩者5’末端的前九個核苷酸與BCL2cDNA 第3287 至3279 之間的堿基互補。在慢性淋巴細胞白血病，miR-15a 和miR-16 -1都能直接與BCL2mRNA的3’UTR 作用，在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控BCL -2的表達［3］。BCL -2 蛋白的表達與DLBCL的不良預后有關(guān)，miR -15a 和miR-16 -1 是否與DLBCL 中BCL-2 蛋白表達有關(guān)，現(xiàn)將筆者研究結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本

收集九江學院附屬醫(yī)院病理科2005 ～2010年DLBCL 石蠟標本30≥，隨機選取反應性增生的淋巴結(jié)10≥作為對照。收集患者臨床病理資料，所有組織標本均經(jīng)10%的福爾馬林固定，石蠟包埋。所有組織切片均由兩名高級職稱病理醫(yī)師復審并確診，按照2008年WHO 造血與淋巴組織腫瘤病理學標準進行形態(tài)學和免疫表型分型［1］。

1.2 石蠟組織中提取RNA 及RT-PCR

應用miRNeasy FFPE Kit (QIAGEN 公司)試劑盒提取石蠟組織中的總RNA。cDNA 合成反應體系:100mmol/L dNTPs 0.2μL，1.5μL 逆轉(zhuǎn)錄酶，逆轉(zhuǎn)錄Buffer1.5μL，RNA 酶抑制劑0.2μL，無RNA 酶水4.5μL，3μL 引物和5μLRNA 樣本，擴增條件如下:16℃30min，42℃30min，85℃5min，將miR-15a 和miR -16 -1 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。miR -15a 和miR -16 -1 逆轉(zhuǎn)錄引物序列、Real -time 引物序列和Taqman 探針序列見表1［4］。

表1 miR-15a 和miR-16 -1 引物序列

1.3 熒光實時定量PCR

反應體系總體積為30μL，含cDNA1.35μL，引物及探針Mix (20 ×，ABI 公司)1μL，TaqMan通用混合物(2 ×，ABI 公司)20μL，無核酸酶水7.65μL。在熒光定量PCR 儀上進行實時定量PCR檢測，每個樣本重復3 次，擴增條件為94℃5min，94℃15s、60℃40s，40個循環(huán)，軟件分析其Ct值。用U6 作為內(nèi)參，結(jié)果以相對CT 值表示。

1.4 免疫組織化學染色

采用MaxVision 兩步法檢測DLBCL 中Ki-67、Bcl-2的表達情況。兩種抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司。采用PBS 緩沖液代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定:Ki -67 陽性表達率＜50%記為(-)，≥50%記為(+)。Bcl -2 陽性腫瘤細胞百分率≥30% 記為 (+ )， ＜30% 記為(-)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用均數(shù)±標準誤(x ± s)表示，miR-15a 和miR-16 -1 在兩組之間表達的比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-15a 和miR -16 -1 在彌漫性大B 細胞淋巴瘤中的表達

DLBCL 組及反應性增生淋巴結(jié)組miR -15a表達分別為2.81 ～22.65 (5.45 ±0.79)和3.12～28.17 (8.31 ±0.85);兩組miR-16 -1 表達分別為1.78 ～24.57 (4.56 ±0.87)和2.56 ～29.43(7.47 ±1.02)，miR -15a 和miR -16 -1 在腫瘤組織中較正常組織低表達(p＜0.05)。所有DLBCL 病例通過CD10、Bcl -6、MUM -1 免疫標記進行分類，免疫組化結(jié)果顯示11≥(36.7%)為GC 型DLBCL，19≥(63.3%)為非GC 型DLBCL。miR-15a 和miR -16 -1 表達量在GC 型DLBCL 和非GC 型DLBCL 組之間差異無統(tǒng)計學意義(詳見表2)。

表2 DLBCL 中miR-15a、miR-16 -1的表達與各參數(shù)之間的關(guān)系(CT 值，x±s)

2.2 miR-15a、miR-16 -1的表達與Ki-67、bcl-2 表達的相關(guān)性

30≥DLBCL 中有13≥表達bcl - 2 (占43.3%，圖1)，17≥Ki-67≥50% (占56.7%，圖2)。miR-15a、miR-16 -1 表達水平與bcl-2蛋白表達、高增殖指數(shù)(Ki -67≥50%)呈負相關(guān)。

圖1 DLBCL，Bcl-2 在腫瘤細胞膜和胞質(zhì)陽性表達(EnVision 法 ×400)

圖2 DLBCL，Ki-67 在腫瘤細胞核陽性表達(EnVision 法 ×400)

3 討論

miRNA的主要功能是調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在與機體生長、發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)基因的表達。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 在造血細胞分化發(fā)育、免疫細胞功能調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用［2］。國外多項研究表明，MicroRNA 可以作為原癌基因或抑癌基因影響腫瘤的形成。本研究表明miR-15a 和miR-16 -1 在DLBCL 組較反應性增生的淋巴結(jié)組表達下降，與Eis 等［5］的研究結(jié)果相同。miR-15a 和miR -16 -1 在DLBCL 中表達的下降是否影響腫瘤的形成?Cimmino 等研究發(fā)現(xiàn)miR-15a 和miR-16 -1 兩者5’末端的前9個核苷酸與BCL2cDNA 第3287 至3279 之間的堿基互補。在慢性淋巴細胞白血病，miR -15a 和miR-16 -1 都能直接與BCL2mRNA的3’UTR 作用，在轉(zhuǎn)錄后水平負向調(diào)控Bcl-2的表達［3］。

然而在濾泡性B 細胞淋巴瘤(FL)和彌漫性大B 細胞淋巴瘤(DLBCL)，BCL2 基因的易位(如濾泡性淋巴瘤的標志t (14;18))將BCL2 基因置于IgH 基因啟動子下游，理論上會產(chǎn)生BCL2蛋白的高表達［6］。在DLBCL，20 -30%病例出現(xiàn)BCL2 基因易位，BCL2 基因易位與BCL2 蛋白的表達是否相關(guān)，多種報道不一致［7，8］。而miR -15a 和miR-16 -1 是否影響DLBCL 中BCL2 蛋白的表達，未有相關(guān)研究報道。本研究通過熒光定量PCR 檢測30≥彌漫性大B 細胞淋巴瘤中miR-15a 和miR-16 -1的表達量，免疫組化檢測BCL-2 和Ki-67 蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)miR -15a、miR-16 -1 表達水平與BCL-2 蛋白表達、高增殖指數(shù)(Ki-67≥50%)呈負相關(guān)，因而推測BCL-2可能是miR -15a 和miR -16 -1 發(fā)揮作用的靶基因。bcl-2 基因是一種細胞凋亡相關(guān)基因，其表達和調(diào)控是影響細胞凋亡的關(guān)鍵因素之一，在細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑中發(fā)揮著重要的作用。miR-15a 和miR-16 -1 是一種腫瘤抑制基因，其表達水平的下調(diào)可能對bcl -2 基因的靶向抑制作用減少，BCL-2 基因表達增加，參與DLBCL 形成的凋亡抑制途徑。但miR -15a 和miR -16 -1 在DLBCL 是否還參與其他信號通路的調(diào)節(jié)以及具體機制，還需進一步研究。

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