復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

ETS2在乳腺癌細(xì)胞中調(diào)控CXCR4轉(zhuǎn)錄的機制研究

顧婷婷 谷圣美 金偉 吳炅

復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科，復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海200032

背景與目的：腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因。趨化因子受體CXCR4與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究探討轉(zhuǎn)錄因子ETS2(人紅血細(xì)胞增多癥病毒致癌基因同源體2)對人乳腺癌細(xì)胞中趨化因子受體CXCR4表達(dá)的影響，以及ETS2調(diào)控CXCR4轉(zhuǎn)錄的分子機制。方法：在MCF-7和MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株中，本研究通過瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，以及RNAi技術(shù)，檢測過表達(dá)ETS2或抑制ETS2的表達(dá)。然后分別應(yīng)用RT-PCR以及ELISA檢測CXCR4 mRNA的表達(dá)和蛋白水平，熒光酶素報告基因?qū)嶒灆z測啟動子活性，ChIP實驗檢測結(jié)合到CXCR4啟動子上的ETS2的量。并且對CXCR4啟動子上的2個ETS結(jié)合位點進(jìn)行突變，通過熒光報告基因?qū)嶒?，檢測突變對CXCR4啟動子活性的影響。結(jié)果：轉(zhuǎn)染了ETS2過表達(dá)質(zhì)粒的MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中，CXCR4的表達(dá)在mRNA和蛋白水平都升高；報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示，ETS2通過激活CXCR4啟動子的活性提高CXCR4的表達(dá)；通過ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了ETS2表達(dá)質(zhì)粒的MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中，結(jié)合到CXCR4啟動子上的ETS2的蛋白量増高，提示ETS2通過直接結(jié)合到CXCR4啟動子上，從而提高CXCR4啟動子的活性；利用RNA干擾技術(shù)，抑制ETS2的表達(dá)，可以顯著減弱CXCR4啟動子的活性，降低CXCR4的表達(dá)和結(jié)合到CXCR4啟動子上的ETS2的量；熒光酶素報告基因的結(jié)果顯示，任意一個位點的突變都降低了CXCR4啟動子的活性，2個位點的同時突變使CXCR4啟動子的活性進(jìn)一步降低。結(jié)論：在人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，ETS2通過直接結(jié)合到CXCR4啟動子上的2個結(jié)合位點(-540到-535和-240到-235)，活化CXCR4啟動子活性，從而對CXCR4發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。

乳腺癌；ETS2；轉(zhuǎn)錄；CXCR4；啟動子

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，腫瘤轉(zhuǎn)移與死亡率密切相關(guān)。臨床研究證實，趨化因子受體CXCR4表達(dá)水平與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在顯著相關(guān)［1-2］。近幾年發(fā)現(xiàn)，一些ETS轉(zhuǎn)錄因子可以影響CXCR4的轉(zhuǎn)錄，例如ETS1、PEA3，通過結(jié)合到CXCR4啟動子上，發(fā)揮上調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性的作用［3-5］；ETS蛋白通過識別位于下游靶基因的啟動子或增強子區(qū)域的EBS結(jié)構(gòu)域(ETS binding site，EBS)而調(diào)控靶基因的表達(dá)和功能［6］。

本研究利用瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)和RNAi技術(shù)過表達(dá)ETS2或抑制ETS2的表達(dá)后，探討 ETS2對CXCR4轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平的影響，并進(jìn)一步研究ETS2是否可結(jié)合在CXCR4啟動子序列上，參與對CXCR4轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)。

1 材料和方法

1.1 材料

MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)腫瘤醫(yī)院中心實驗室培養(yǎng)傳代，ETS2表達(dá)質(zhì)粒(pCMV6-XL5-ETS2)及空白對照質(zhì)粒(pCMV6-XL5)購自O(shè)rigene公司，CXCR4野生型啟動子報告基因載體pGL2-CXCR4(-2632～+86)，CXCR4突變型啟動子報告基因載體pGL2-CXCR4mut，均由復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中心實驗室構(gòu)建，LipofectamineTM2000，Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，總RNA抽提試劑及RT-PCR試劑盒購自Ivitrogen公司，引物由上海Sangon公司合成，CXCR4抗體購自ABCAM公司，ELISA試劑盒購自CUSABIO BIOTECH公司，ETS2抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，ChIP試劑盒購自美國Millipore公司，ETS2 siRNA購自上海吉瑪生物公司，報告基因?qū)嶒炘噭┖匈徸訮romega公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時轉(zhuǎn)染

人乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231用L15培養(yǎng)、MCF-7用RPMll640培養(yǎng)，所有培養(yǎng)基添加10% FBS。置于37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用0.25%的胰蛋白酶消化，按1∶3的比例傳代。轉(zhuǎn)染前1 d，以5×105/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，次日細(xì)胞長滿瓶底約80%時，用OPTI-MEM培養(yǎng)基稀釋的質(zhì)粒/LipofectamineTM2000復(fù)合物(4 μg/10 μL)加入細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后棄去轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)基。實驗細(xì)胞分為以下3組：未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和轉(zhuǎn)染ETS過表達(dá)質(zhì)粒組。

1.3 RT-PCR檢測CXCR4 mRNA含量

轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細(xì)胞。采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA(按TRIzol抽提試劑說明書進(jìn)行)，采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)。CXCR4引物序列為：上游引物：5’-CAGCAGGTAGCAAAGTGA -3’；下游引物：5’-AGCGTGATGAC AAAGAGG-3’，擴增產(chǎn)物為389 bp。ETS2引物序列為：上游引物：5’-GTGGACCTATTCAGCTGTGG-3’；下游引物：5’-TTCCCCGACGTCTTGTG GAT-3’，擴增產(chǎn)物為389bp。GAPDH引物序列：上游引物：5’-GGGAGCCAAAAG GGTCATCATCTC-3’；下游引物：5’-CCATGCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3’，擴增產(chǎn)物353 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 1 min、58 ℃ 1 min，72 ℃1.5 min，72 ℃延伸10 min，指數(shù)擴增期33個循環(huán)。PCR產(chǎn)物4 ℃保存。取10 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物在TBE緩沖液中1.2%的瓊脂糖凝膠電泳40 min，電壓130 V，結(jié)果通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。實驗重復(fù)2次。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)

轉(zhuǎn)染后48 h，ELISA法檢測培養(yǎng)液上清CXCR4蛋白水平，按照試劑盒說明書操作。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值進(jìn)行計算。

1.5 熒光報告基因?qū)嶒?/p>

細(xì)胞處理同上，采用LipofectamineTM2000分別共轉(zhuǎn)染pGL2-Basic(陰性對照)，pGL2-CXCR4，pGL2-CXCR4mut，ETS2質(zhì)?；蚩召|(zhì)粒。每種質(zhì)粒用量均為5 μg/孔。同時分別共轉(zhuǎn)染pRL-TK 20 ng/孔作為內(nèi)參。在熒光素酶檢測儀器上進(jìn)行檢測，讀取595 nm下的吸光度(A)值以得到相對熒光蛋白濃度。實驗重復(fù)3次，數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值進(jìn)行計算。

1.6 免疫共沉淀

轉(zhuǎn)染細(xì)胞48 h后，按說明書步驟操作，細(xì)胞在15 cm平板中培養(yǎng)后，加入1%甲醛，37 ℃溫育10 min。PBS清洗細(xì)胞2次后收集并用TNT裂解液(20 mmol/L Tris-HCl，pH=7.4，200 mmol/L NaCl，1%TritonX-100，1 mmol/L PMSF和1% aprotinin)冰浴處理。采用超聲剪切細(xì)胞DNA，使DNA剪切成200～500 bp片斷，并采用2 μg ETS2抗體免疫共沉淀。通過Protein A磁珠收集抗體/蛋白復(fù)合物，并使用ChIP緩沖液(5%SDS，l mmol/L EDTA，0.5%牛血清白蛋白和40 mmol/L NaHPO4，pH=7.2)清洗3次。使用1%SDS和1 mmol/L NaHCO3洗滌免疫復(fù)合物，加入200 mmol/L NaCl及RNaseA，在65 ℃溫育4 h，解交聯(lián)。采用蛋白酶K處理樣品2 h，柱純化提取DNA。采用PCR擴增檢測CXCR4啟動子DNA。引物包括CXCR4啟動子-401到-142序列(順義鏈：5’-CAGCAAGTCACTCCC-3’，反義鏈：5’-GGAGAGGTGCGCGGC-3’)。樣品分為3組：IgG組(陰性對照)、Input組(陽性對照)和ETS2組。

1.7 RNA干擾實驗

轉(zhuǎn)染前1 d，以5×105/孔的密度將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中，次日細(xì)胞長滿瓶底約40%～70%時，分別轉(zhuǎn)染ETS2特異的siRNA和NT-siRNA(100 pmol siRNA/5 μL LipofectamineTM2000)，轉(zhuǎn)染后48 h檢測基因沉默效果。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均由SPSS Software 13.0統(tǒng)計軟件分析：ELISA檢測到的CXCR4蛋白水平，以及熒光啟動子報告基因?qū)嶒炛兴玫降慕Y(jié)果，采用student t檢驗分析；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過表達(dá)ETS2對CXCR4表達(dá)及CXCR4啟動子活性的影響

RT-PCR與ELISA結(jié)果顯示，過表達(dá)ETS2后，與對照組相比，MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中CXCR4的mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著升高(ELISA結(jié)果，P＜0.05，圖1)。熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，過表達(dá)ETS2后，與對照組相比，CXCR4啟動子活性顯著增強(P＜0.05，圖2)。ChIP實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)ETS2后，結(jié)合到CXCR4啟動子上的ETS2的量顯著增加(圖3)。

2.2 抑制ETS2表達(dá)對CXCR4表達(dá)及CXCR4啟動子活性的影響

RT-PCR與ELISA結(jié)果顯示，抑制ETS2表達(dá)后，與對照組相比，MDA-MB-231和MCF-7人乳腺癌細(xì)胞中CXCR4的mRNA表達(dá)和蛋白水平顯著降低(ELISA結(jié)果，P＜0.05，圖4)。熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，抑制ETS2表達(dá)后，與對照組相比，CXCR4啟動子活性顯著下降(P＜0.05，圖5)。ChIP實驗結(jié)果顯示，抑制ETS2表達(dá)后，結(jié)合到CXCR4啟動子上的ETS2的量顯著減少(圖6)。

2.3 突變兩個ETS2結(jié)合位點對CXCR4啟動子活性的影響

熒光報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與野生型CXCR4啟動子相比，ETS2結(jié)合位點中任意一個位點的突變都顯著降低了CXCR4啟動子的活性，兩個位點(-540到-535和-240到-235)的同時突變則導(dǎo)致了CXCR4啟動子活性的進(jìn)一步降低(圖7)。

圖 1 轉(zhuǎn)染ETS2過表達(dá)質(zhì)粒48 h 后CXCR4的mRNA表達(dá)情況Fig. 1 The CXCR4 mRNA expression and protein level of MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48h of transfection

圖 2 轉(zhuǎn)染ETS2過表達(dá)質(zhì)粒48 h后CXCR4的啟動子活性Fig. 2 The CXCR4 promoter activity of MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48 h of transfection

圖 3 轉(zhuǎn)染ETS2過表達(dá)質(zhì)粒48 h后結(jié)合到CXCR4的啟動子上的ETS2蛋白情況Fig. 3 The amount of ETS2 protein binding to CXCR4 promoter in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48 h of transfection

圖 4 轉(zhuǎn)染ETS2 siRNA 48 h 后CXCR4的mRNA表達(dá)情況Fig. 4 The CXCR4 mRNA expression and protein level of MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48 h of ETS2 siRNA transfection

圖 5 轉(zhuǎn)染ETS2 siRNA 48 h 后CXCR4的啟動子活性Fig. 5 The CXCR4 promoter activity of MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48 h of ETS2 siRNA transfection

圖 6 轉(zhuǎn)染ETS2 siRNA 48 h后，結(jié)合到CXCR4的啟動子上的ETS2蛋白情況Fig. 6 The amount of ETS2 protein binding to CXCR4 promoter in MDA-MB-231 cells and MCF-7 cells after 48 h of ETS2 siRNA transfection

圖 7 CXCR4啟動子上的兩個ETS2結(jié)合位點的突變對CXCR4啟動子活性的影響Fig. 7 The impact on CXCR4 promoter activity of the mutation of two ETS2 binding sites on CXCR4 promoter

3 討 論

近年來，腫瘤生物研究方面的結(jié)果證實，CXCR4在乳腺癌以及其他腫瘤中具有重要的作用，特別是疾病的轉(zhuǎn)移擴散［7-9］。

Dewan等［1］將CXCR4低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞接種到SCID鼠，8～9周后僅在接種部位形成較小腫瘤病灶，而未發(fā)生遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。但是接種了CXCR4高表達(dá)的MDA-MB-231細(xì)胞后，3周內(nèi)即可形成較大的腫瘤病灶，并發(fā)生明顯遠(yuǎn)處及內(nèi)臟轉(zhuǎn)移。

在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究中，發(fā)現(xiàn)與沒有發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的患者相比，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的乳腺癌組織中，CXCR4的表達(dá)顯著升高，提示CXCR4在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中起重要作用［10］。

2012年，Jin等［11］報道，抑制CXCR4表達(dá)后，乳腺癌細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞層的黏附和侵襲都顯著下降。2013年，Ling等［12］研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4的拮抗劑AMD3465能夠作用在構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞上，調(diào)控腫瘤信號，包括STAT3途徑，預(yù)防乳腺癌的進(jìn)一步生長及轉(zhuǎn)移，提示CXCR4是乳腺癌治療的新靶點。Yang等［13］報道，初始化療后，CXCR4的表達(dá)顯著下降，這種改變提示CXCR4可能是一個評估乳腺癌新輔助化療的療效的標(biāo)志物。2013年，一篇關(guān)于CXCR4對乳腺癌預(yù)后影響的META分析中，發(fā)現(xiàn)CXCR4的高表達(dá)，特別是在細(xì)胞質(zhì)中，可能是乳腺癌患者不良預(yù)后的一個指標(biāo)［14］。

CXCR4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是多方面的，例如ETS1、PEA3和HIF-1α都可以通過結(jié)合到CXCR4啟動子上，發(fā)揮上調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性的作用［3-5］；相反，KLF-2則通過結(jié)合到CXCR4啟動子上，下調(diào)其轉(zhuǎn)錄活性［15］。其中，ETS1和PEA3都屬于細(xì)胞內(nèi)最大的信號依賴轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族-ETS家族(E26 transformation specific)之一。ETS基因具有一個高度保守的同源序列，稱為ETS結(jié)構(gòu)域。磁共振分析顯示，ETS域是一個由85個氨基酸組成的特異的DNA結(jié)合區(qū)，呈翼狀螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋結(jié)構(gòu), 可以識別、結(jié)合嘌呤豐富的DNA核心序列GGAA/T，即EBS結(jié)構(gòu)域(ETS Binding site，EBS)［6］。ETS蛋白通過識別位于下游靶基因的啟動子或增強子區(qū)域的EBS而調(diào)控靶基因的表達(dá)和功能。它存在于與細(xì)胞外基質(zhì)降解及血管生成有關(guān)的許多基因(如integrin α4，stromely-sin-1，u-PA，collagenase等)的5’側(cè)翼調(diào)節(jié)區(qū), 所以ETS家族和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［6］。

實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)ETS2通過直接結(jié)合到CXCR4啟動子上的兩個ETS蛋白結(jié)合位點，增強CXCR4啟動子的活性，上調(diào)CXCR4的表達(dá)。如前所述，CXCR4在乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移中有著重要的作用。因此，ETS2對CXCR4的調(diào)控可能引起乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力的改變。

與此同時，抑制ETS2表達(dá)減弱了CXCR4啟動子的活性，下調(diào)CXCR4的表達(dá)。由此推斷，如果阻斷這一腫瘤細(xì)胞內(nèi)的調(diào)控環(huán)節(jié)，可能為抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移提供新的思路。

本研究采用的兩種細(xì)胞，MCF-7是ER陽性乳腺癌細(xì)胞，MDA-MB-231細(xì)胞是三陰性乳腺癌細(xì)胞。CXCR4的轉(zhuǎn)錄在MDA-MB-231細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞中都可以被激活，提示了這個過程是激素非依賴性的。

在探討ETS蛋白成員PEA3調(diào)控CXCR4轉(zhuǎn)錄的研究中，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PEA3能夠促進(jìn)裸小鼠乳腺癌模型的肺轉(zhuǎn)移瘤生長［5］。本研究如進(jìn)行后續(xù)實驗，可進(jìn)一步探討ETS2是否具有促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的作用。

綜上所述，過表達(dá)ETS2具有上調(diào)CXCR4基因轉(zhuǎn)錄的作用，其具體作用機制是ETS2通過結(jié)合到CXCR4啟動子上的2個ETS2結(jié)合位點，激活CXCR4啟動子的活性，從而激活CXCR4的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)CXCR4的表達(dá)。研究結(jié)果提示ETS2可能是一個潛在的乳腺癌轉(zhuǎn)移分子標(biāo)志物，有望成為乳腺癌診斷與治療過程中新的分子靶點。

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Mechanism of ETS2 modulating transcriptional activity of the CXCR4 gene in breast cancer cells

GU Ting-ting, GU Sheng-mei, JIN Wei, WU Jiong (Department of Breast Surgery, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

WU Jiong E-mail: Wujiong1122@sina.vip.com

Background and purpose: Tumor metastasis is a main reason of breast cancer patients’ death. This study aimed to discuss whether or how the transcription factor ETS2 regulate CXCR4 transcription and the molecular mechanism of ETS2 modulating transcriptional activity of CXCR4 gene in human breast cancer cells. Methods: In MCF-7 breast cancer cell lines and MDA-MB-231 breast cancer cell lines, through transient transfection, as well as RNAi technology, the expression of ETS2 was overexpressed or inhibited was detected. RT-PCR and ELISA was used respectively to detect CXCR4 mRNA expression and protein level. Luciferase reporter gene assay was applied to detect CXCR4 promoter activity, and ChIP for detecting the amount of ETS2 protein binding to CXCR4 promoter. Two binding sites of CXCR4 promoter were mutated to detect the impact on the activity of CXCR4 promoter by gene mutations. Results: After transfected with ETS2 expression vector in MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines, the mRNA expression and protein level of CXCR4 were elevated. The result of luciferase reporter gene assay indicated that overexpression of ETS2 activated CXCR4 promoter. ChIP assay demonstrated that the amount of ETS2 protein binding to CXCR4 promoter increased after ETS2 transfection. This result indicated that ETS2 mayactivate CXCR4 promoter through directly binding with CXCR4 promoter. Inhibition of ETS2 expression using RNAi could significantly attenuate CXCR4 promoter activity and reduce expression of CXCR4. Two ETS binding sites of CXCR4 promoter were mutated and the result of luciferase reporter gene assay proved that, an arbitrary point mutations attenuated CXCR4 promoter activity, while mutation of both binding sites further attenuated CXCR4 activity. Conclusion: In MCF-7 and MDA-MB-231 breast cancer cell lines, overexpression of ETS2 could activate CXCR4 promoter and the transcription of CXCR4 through directly binding to two ETS2 binding sites (-540 to -535 and -240 to -235) of CXCR4 promoter.

Breast cancer; ETS2; Transcription; CXCR4; Promoter

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.11.007

R737.9

：A

：1007-3639(2013)11-0892-08

2013-04-25

2013-10-15）

吳炅 E-mail:Wujiong1122@sina.vip.com