華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢430014

白花丹醌對人肝癌SK-hep-1細胞增殖及侵襲的影響

曹曉淬 王卉 張紅梅 劉怡雯 盧忠心

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢市中心醫(yī)院檢驗科，湖北 武漢430014

背景與目的：白花丹醌是中藥白花丹的主要活性成分，對多種腫瘤細胞具有殺傷作用。本研究旨在觀察白花丹醌對人肝癌SK-hep-1細胞增殖及侵襲的影響，并初步探討其作用機制。方法：在體外應用MTS法、軟瓊脂克隆形成實驗、流式細胞術及Transwell小室觀察白花丹醌對細胞增殖及侵襲的影響；并通過RTPCR檢測白花丹醌對p21、MMP-2及MMP-9的mRNA表達影響。結果：白花丹醌能夠明顯抑制肝癌SK-hep-1細胞的增殖和克隆形成，且具有劑量依賴性，其半數抑制率為22.04 μ mol/L。細胞周期分析顯示，白花丹醌處理后S期細胞數減少，G0/G1期細胞增多；并且白花丹醌能夠抑制SK-hep-1細胞的黏附和侵襲轉移。RT-PCR結果顯示白花丹醌能夠促進p21表達，而抑制MMP-2及MMP-9的表達。結論：白花丹醌可能是通過上調p21及下調MMP-2/ MMP-9的表達水平，抑制人肝癌SK-Hep-1細胞增殖和侵襲。

增殖；腫瘤轉移；白花丹醌；肝癌；SK-hep-1

肝細胞癌是最常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位，而我國肝癌發(fā)病人數約占全球的55%，發(fā)病率居我國惡性腫瘤第2位［1］，病死率在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中居第3位，僅次于胃癌和食道癌［2］。目前肝癌的治療主要采用外科手術切除，而切除后使用化療對肝癌的作用非常有限，因此新藥的研究十分必要。白花丹醌是中藥白花丹的主要活性成分，具有抗菌消炎、抗生殖、抗凝等作用。目前有報道表明，白花丹醌對多種腫瘤具有殺傷作用，如Raja、Calu-1、HeLa及Wish等細胞［3］。本研究旨在探討白花丹醌對人肝癌SK-hep-1細胞增殖及侵襲的影響，為治療肝癌尋找新的治療藥物。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人肝細胞癌細胞SK-Hep-1購自美國標準生物品收藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。

1.2 主要試劑

白花丹醌購自Sigma公司，Transwell小室購自Corning公司， CellTiter 96?AQueous MTS Reagent Powder、低熔點瓊脂糖購自Promega公司(USA，批號：56966)，吩嗪硫酸甲酯(Phenazine methosulfate，PMS) 購自Sigma-Aldrich公司，MTT、碘化丙啶(Propidium Iodide，PI) 購自Sigma公司，F(xiàn)ACS Optimized sheath fluid、Matrigel基質膠購自BD Biosciences Pharmingen公司，SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自Toyobo公司。

1.3 細胞培養(yǎng)及藥物處理

人肝細胞癌細胞SK-Hep-1以含有10%胎牛血清，100 IU/mL青、鏈霉素，1×丙酮酸鈉及1×非必需氨基酸的MEM完全培養(yǎng)液，在37 ℃、CO2體積分數為5%的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。白花丹醌溶解于二甲亞砜配成0.1 mol/L儲備液，并用無血清的MEM完全培養(yǎng)液配成1 mmol/L的工作液。

1.4 MTS法檢測白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞的抑制率

處于對數期的SK-Hep-1細胞經胰酶消化、計數，并用MEM培養(yǎng)液調整細胞濃度為5×105個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL。CO2體積分數為5%、37 ℃的條件下溫育24 h后，往每孔中分別加入不同濃度的含白花丹醌培養(yǎng)液，每孔100 μL，使白花丹醌的終濃度為2.5、5、10、20和40 μmol/L。每種藥物濃度設5個復孔，另設5個陰性對照孔。培養(yǎng)48 h后，每孔中加入40 μL MTS工作液。37 ℃溫育2 h后用酶標儀于490 nm處檢測A值。計算抑制率(%)：抑制率(%)=1- A實驗組均值/ A對照組均值×100%。

1.5 流式細胞術檢測

人肝癌SK-Hep-1細胞經5、10 μmol/L的白花丹醌處理12 h后，用胰酶進行消化，1 000 r/min離心5 min后收集細胞，再用PBS洗滌2次。將收集的細胞用70%的冰乙醇重懸細胞于-20 ℃固定過夜。1 000 r/min離心10 min去除乙醇，PBS液洗滌離心2次，調整細胞濃度為1×106/mL。在細胞沉淀中加入終濃度為10 μg/mL的RNase A，37 ℃水浴30 min，冰浴終止RNase A作用，加入終濃度為0.1%的Triton X-100和50 μg/mL的PI染液，混勻，4 ℃避光溫育40 min。將細胞用400目篩網過濾，上流式細胞儀檢測，每次檢測2×104個細胞，F(xiàn)ACScalibur流式細胞儀測定熒光強度，激發(fā)波長488 nm，使用CELLQUEST軟件采集數據Modfit LT分析軟件進行DNA含量分析，確定細胞周期分布。

1.6 軟瓊脂克隆形成實驗

將配制好的1.5%瓊脂糖放置于水浴鍋中融化。待其降溫至37 ℃時，用MEM培養(yǎng)基將1.5%的瓊脂糖稀釋為0.5%瓊脂糖，加入12孔板中，每孔1 mL，凝固后備用。將預先用5 μmol/L、10 μmol/L的白花丹醌處理6 h的人肝癌SK-Hep-1細胞消化計數，并用含0.3%瓊脂糖MEM培養(yǎng)基將細胞濃度調整為200個/mL，分別加入到預先鋪好的半固體培養(yǎng)基的12孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL，使其形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置37 ℃、CO2體積分數為5%的溫箱內培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中每孔加入0.5 mL的MEM培養(yǎng)基，使瓊脂保持適當的濕度。2周后在12孔板中每孔內加入0.5 mL MTT (0.5 mg/mL)。37 ℃避光溫育30 min后，顯微鏡下計數所形成細胞數大于50個的克隆數，計算克隆形成率。克隆形成率(%)=形成克隆數/接種細胞數×100%。

1.7 細胞黏附率實驗

將4 ℃預冷后的96孔板每孔加入25 μL Matrigel膠(0.2 mg/mL)，37 ℃溫育12 h后，每孔加入含2%BSA的PBS 20 μL，封閉非特異性位點。將處于對數生長期的SK-Hep-1細胞，經胰酶消化計數，用含0.1% BSA的MEM調整濃度至5×105/mL，100 μL/孔加入到已包被Matrigel膠的96孔板中，每組設5個復孔，實驗組96孔板中每孔加入白花丹醌工作液，使終濃度為1 μmol/L及2.5 μmol/L (經試驗證明2.5 μmol/L的白花丹醌對細胞的增殖無影響，故本研究中對侵襲和黏附能力的測定采用1 μmol/L及2.5 μmol/L兩個濃度組)，對照組96孔板中加入無血清MEM培基，37 ℃、CO2體積分數為5%的條件下溫育1 h。

PBS沖洗棄去未黏附的細胞，每個細胞培養(yǎng)孔中加入20 μL的MTS工作液。CO2體積分數為5%、37 ℃下溫育2 h，490 nm處檢吸光度(A)值。計算細胞黏附率，細胞黏附率(%)=A實驗組均值/A對照組均值×100%。

1.8 Transwell小室檢測

Transwell小室4 ℃預冷，將25 μL的趨化因子FN(0.2 mg/mL)涂在小室底部，超凈臺內風干。再將25 μL的Matrigel膠(0.2 mg/mL)包被于小室上層，37 ℃、CO2體積分數為5%的環(huán)境中溫育1 h后備用。取SK-Hep-1細胞，用PBS溶液沖洗3遍，計數，用含0.1%BSA的MEM培養(yǎng)基調整濃度至1×106/mL，用量100 μL，加入到已包被Matrigel膠且底部涂有趨化因子FN的Transwell小室上層，在24孔板中加入含血清的MEM培養(yǎng)基，600 μL/孔，將小室浸入24孔板的條件培養(yǎng)基中。將小室分為3組，每組設3個平行小室，實驗組在小室上層加入白花丹醌工作液，使終濃度為1 μmol/L及2.5 μmol/L，對照組小室中加入無血清MEM培基，37 ℃、CO2體積分數為5%的環(huán)境中溫育24 h。用棉棒擦去微孔濾膜上未侵襲的細胞，HE染色，中性樹膠封片。200倍光學顯微鏡下計數膜上、下、左、右、中5個視野穿過濾膜的細胞數，計算平均值。

1.9 RT-PCR檢測

5 μmol/L及10 μmol/L的白花丹醌處理人肝癌SK-Hep-1細胞12 h后，用TRIzol提取細胞總RNA，逆轉錄成 cDNA，然后進行RT-PCR試驗。反應體系為每管反應體系如下：SYBR Green Real-Time PCR Master Mix 12.5 μL，上游引物(2.5 μmol/L)2 μL，下游引物(2.5 μmol/L) 2 μL，cDNA工作液5 μL，ddH2O 3.5 μL。PCR擴增條件為：95 ℃預變性60 s；然后95 ℃變性15 s，退火15 s 60 ℃)，72 ℃延伸45 s，擴增40個循環(huán)。每次延伸步驟結束，摻入到DNA雙鏈中SYBR Green的熒光強度，反映當時的PCR產物形成量，所以在每個循環(huán)延伸階段采集數據。用β-actin基因的表達量作為內參，校正目的基因的表達量，計算公式為：相對表達量= 2-ΔCT，ΔCT=CT(目的基因)-CT(β-actin)。引物序列檢索自在線引物庫primer bank，引物由北京奧科生物技術有限責任公司合成并純化。各檢測基因及引物序列見(表1)。

1.10 統(tǒng)計學處理

表 1 Real-time PCR 引物基因名稱引物序列Tab. 1 Primer sequence for real-time PCR

2 結 果

2.1 白花丹醌抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的體外增殖

MTS法檢測結果顯示，不同濃度的白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞增殖均有抑制作用，半數抑制率的濃度為22.04 μmol/L(圖1)。

圖 1 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞增殖抑制作用Fig. 1 Inhibition effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells proliferation.

2.2 白花丹醌影響人肝癌SK-Hep-1細胞的周期分布

流式細胞儀檢測結果顯示，5 μmol/L及10 μmol/L白花丹醌作用細胞后，處于G0/G1期的細胞增多，而處于S期及G2/M期的細胞數減少，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖2，表2)。

2.3 白花丹醌可抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的克隆形成

軟瓊脂克隆形成實驗結果顯示，人肝癌SKHep-1細胞經5 μmol/L及10 μmol/L的白花丹醌處理后其克隆形成能力明顯降低(對照組的克隆形成率為12.67%，5 μmol/L組為4.50%，10 μmol/L組為2.50%，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖3)。

2.4 白花丹醌抑制人肝癌SK-Hep-1細胞黏附率

研究結果顯示，人肝癌SK-Hep-1細胞經白花丹醌處理后，1 μmol/L組細胞的黏附率為77.80%，而2.5 μmol/L組細胞的黏附率為60.00%，與對照組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖4)。

圖 2 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞周期分布的影響Fig . 2 Inhibition effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells cell cycle distribution

表 2 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞周期分布的影響Tab. 2 Inhibition effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells cell cycle distribution

圖 3 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞克隆形成率的影響Fig. 3 Effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells clonogenicity potential

圖 4 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞黏附能力的影響Fig. 4 Inhibition effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells adhesion potential

2.5 白花丹醌可抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的體外侵襲

1 μmol/L及2.5 μmol/L白花丹醌均能夠抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的體外侵襲，其穿膜細胞數與對照組相比明顯降低，平均穿膜細胞數對照組為216，1 μmol/L組為97，2.5 μmol/L組為35，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05，圖5)。

2.6 白花丹醌可抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的p21、MMP-2及MMP-9 mRNA表達

本研究選擇與細胞周期相關的基因p21以及與侵襲相關的基因MMP-2及MMP-9進行了檢測，結果顯示，5 μmol/L和10 μmol/L白花丹醌處理組細胞p21 mRNA表達是對照組的172.67%和293.7%(P＜0.05)，MMP-2 mRNA表達是對照組的61.00%和25.33%(P＜0.05)，MMP-9 mRNA表達是對照組的51.33%和33.00%(P＜0.05)，表明白花丹醌可調節(jié)腫瘤增殖及轉移相關基因的轉錄(圖6)。

圖 5 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞侵襲能力的影響Fig. 5 Effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells invasion potential.

圖 6 白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞p21、MMP-2及MMP-9 mRNA表達的影響Fig. 6 Effect of plumbagin on SK-Hep-1 cells p21, MMP-2 and MMP-9 mRNA expression

3 討 論

白花丹醌是從傳統(tǒng)藥物白花丹中提取出來的一種類似于維生素K3的藥物成分［4］，具有抗炎、抗菌、抗凝［5］、降低血脂［6］等作用。有研究表明白花丹醌對多發(fā)性骨髓瘤、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌等多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用［7-11］。但鮮見白花丹醌抑制人肝癌SK-Hep-1細胞系增殖及侵襲能力的報道。

本研究首先通過MTS法觀察了人肝癌SKHep-1對白花丹醌的敏感性，本研究發(fā)現(xiàn)，5～40 μmol/L的白花丹醌對人肝癌SK-Hep-1細胞均有抑制作用，隨著濃度的增高，細胞的增殖能力逐漸下降，其半數抑制率為22.04 μmol/L；并能夠明顯抑制人肝癌SK-Hep-1細胞的自我更新及無限增殖能力。Kuo等［12］發(fā)現(xiàn)白花丹醌能使乳腺癌細胞G2/M期阻滯，本研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌能使人肝癌SK-Hep-1細胞處于G0/G1期的細胞數增多，而處于S期及G2/M期的細胞數減少，與上述文獻報道一致。本研究還應用Matrigel膠Transwell小室重建BM(基底膜)的侵襲模型觀察了白花丹醌對人肝癌SKHep-1細胞體外侵襲能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)白花丹醌能夠顯著降低人肝癌SK-Hep-1細胞的體外侵襲能力。本研究對白花丹醌抑制人肝癌SKHep-1的增殖和體外侵襲能力的機制進行了初步探討。p21作為細胞周期抑制蛋白，可以通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)的活性來控制細胞由G期進入S期抑制增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)的活性，從而抑制DNA 的合成，使細胞停止分化，出現(xiàn)凋亡［13］。MMPs能夠降解細胞外基質和基底膜，參與許多生理和病理過程，是腫瘤浸潤轉移過程中最重要的調控分子之一，涉及腫瘤浸潤和轉移、血管的生成，在腫瘤的發(fā)展中起關鍵作用。MMP-2是一種鋅依賴性蛋白酶，其作用底物為Ⅳ型膠原、Ⅶ型膠原、Ⅹ型膠原和明膠，而它們是ECM和血管基底膜的主要成分，MMP-2的表達增高與結直腸癌轉移密切相關，可作為臨床判斷結直腸癌轉移及預后等生物學行為的重要參考指標［14］。MMP-9是MMPs中降解基底膜最重要的蛋白酶之一，在組織中MMP-9以酶原的形式由細胞分泌產生，被各種活化因子激活，進而發(fā)揮酶解效應。近年來，國內外學者在許多腫瘤組織中都發(fā)現(xiàn)有較高的MMPs的表達，并且其表達程度與腫瘤的侵襲性有關［15-16］。本研究結果還表明，白花丹醌促進p21mRNA的表達，抑制MMP-2及MMP-9 mRNA的表達。

綜上所述，白花丹醌能有效抑制人肝癌SKHep-1細胞的增殖及體外侵襲能力，而這種作用可能是與上調p21的表達以及抑制MMP-2及MMP-9的表達有關，表明白花丹醌具有抗肝癌作用。

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復旦大學繼續(xù)醫(yī)學教育項目辦班課程表

辦班單位: 復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院《中國癌癥雜志》編輯部

約稿內容請側重于知識的傳播：包括最新的研究進展、診斷標準、治療規(guī)范等。

The effects of plumbagin on proliferation and metastasis in human liver cancer SK-hep-1 cells

CAO Xiao-cui, WANG Hui, ZHANG Hong-mei, LIU Yi-wen, LU Zhong-xin (Department of Clinical Laboratory, Wuhan Central Hospital Affiliated to Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan Hubei 430014, China)

LU Zhong-xin E-mail: lzx71@yahoo.com

Background and purpose: Plumbagin is the main active components of traditional Chinese medicine of plumbago zeylanica. The present studies show that plumbagin has a killing effect on tumor cells. This study aimed to investigate the function and primary mechanism of plumbagin on invasion and metastasis of human liver cancer SK-hep-1 cells. Methods: With the treatment of plumbagin in vitro, cell proliferation and adhesion of SK-hep-1 cells were detected by MTS staining, cell cycle of SK-hep-1 cells were detected by flow cytometry, the selfrenewal and propagation abilities of SK-Hep-1 cells were conducted by colony formation assay , invasion in cells were performed using transwell invasion assay, and the p21 and MMP-2/9 mRNA levels were detected by real-time RT-PCR. Results: With the treatment of plumbagin, SK-Hep-1 cells proliferation was decreased with plumbagin concentrationdependency and the IC50value of plumbagin in SK-Hep-1 cells was 22.04 mmol/L. The colony formation ability of SKHep-1 cells was decreased and the percentage of cells in G0/G1phase was increased in a dose-dependent manner, as compared to control. The cell adhesion and invasion abilities were decreased. The real-time RT-PCR showed that p21 mRNA expression was increased and the MMP-2/9 mRNA was decreased. Conclusion: Plumbagin could suppress the proliferation and invasiveness of human liver cancer SK-hep-1 cells in vitro, and these effects may be by up-regulation of p21 and down-regulation of MMP-2 and MMP-9.

Proliferation; Tumor metastasis; Plumbagin; Hepatocarcinoma; SK-hep-1

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.09.05

R735.7

：A

：1007-3639(2013)09-0721-07

2013-06-06

2013-08-29）

盧忠心 E-mail:lzx71@yahoo.com