張喜利，劉文龍，2，3，賀福元，3，王海琴，楊巖濤，3，石繼連，3，李順祥，4

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥現(xiàn)代化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410208；2.湖南師范大學(xué)生科院，湖南 長沙410081；3.中藥藥性與藥效國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410208；4.湖南省中醫(yī)藥研究院 中藥新藥研究與開發(fā)省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙410013）

中藥的質(zhì)量研究一直是中藥現(xiàn)代化進(jìn)程的“焦點(diǎn)”之一，亦是中藥研究和應(yīng)用的一個(gè)重點(diǎn)與難點(diǎn)。目前，許多中藥專家學(xué)者對此開展了大量的研究，取得了可喜的成效。前期研究表明中藥遺傳基因具有多態(tài)性，且這種基因多態(tài)性現(xiàn)象是引起中藥質(zhì)量不穩(wěn)定——中藥植物體內(nèi)二次代謝產(chǎn)物（中藥有效成分）差異性的內(nèi)因［1-3］。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，亦即中藥遺傳基因的多態(tài)性促成了中藥的蛋白質(zhì)及酶的多樣性，蛋白質(zhì)及酶的多樣性作用于中藥的生長過程從而使得中藥成分波動。故從蛋白質(zhì)（酶）多樣性方面更深層次地探究藥用植物體內(nèi)二次代謝產(chǎn)物——中藥成分的差異情況及規(guī)律，更直觀的、更確切、更具說服力。

本文從鮮魚腥草的總蛋白的提取著手，探索適宜新鮮魚腥草植株的最佳提取總蛋白的方法，建立魚腥草總蛋白含測方法，測算出各植株含總蛋白的量，從蛋白總量的角度初步揭示53株鮮魚腥草的總蛋白存在多樣性，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 儀器

TGL-16LM型高速冷凍離心機(jī)（湖南星科科學(xué)儀器有限公司）；WH-2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；MA110型電子天平（上海天平儀器廠）；DK-8D電熱恒溫水槽（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；Biophotometer核酸蛋白分析儀（德國Eppendorf公司）；ZK-82A型真空冷凍干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器總廠）；LDZX-30KBS立式壓力蒸氣滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；CM-230超純水系統(tǒng)（北京帕思特科技有限公司）；WD-9415F型超聲波清洗器（北京市六一儀器廠）；756型紫外可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；滅菌EP管移液器。

1.2 藥材

魚腥草（Houttuynia cordata Thumb），采自湖南懷化GAP種植基地，由本院中藥鑒定教研室劉塔斯教授鑒定。

1.3 試劑

液氮，三氯乙酸（TCA），丙酮，PVP（上海捷瑞生物工程有限公司），β-巰基乙醇（Sigma Chemical Co.），標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白（BSA，Thermo，23209）；提取溶劑I：10%三氯乙酸和0.07%β-巰基乙醇丙酮液；提取溶劑Ⅱ：0.07%β-ME丙酮溶液；提取溶劑Ⅲ：80%的丙酮溶液；標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用牛血清蛋白（BSA）配制成1.0 mg／mL和0.1 mg／mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液；考馬斯亮藍(lán)G-250染料試劑：稱100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50 mL 95%乙醇后，再加入100 mL 85%磷酸，用超純水稀釋至1 L。

2 方法與結(jié)果

2.1 新鮮魚腥草藥材的預(yù)處理

采收同一產(chǎn)地同一批次鮮魚腥草，去其枯葉、黃葉、斑葉及塵土后，用自來水洗凈后陰干；每單株稱質(zhì)量后分裝于封口袋中，得53株魚腥草樣品，置-44℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 魚腥草總蛋白的提取［4-6］

本文采用三氯乙酸-丙酮沉淀（TCA-acetone）法提取，其步驟如下：（1）分別取各株魚腥草（-44℃凍存）嫩葉約1.0 g，迅速放入預(yù)冷的研缽中，并加入約0.1 g PVP，加液氮研磨成粉末；（2）裝入-20℃預(yù)冷的提取溶劑I（5.0 mL）中，渦旋振蕩1 min，充分混勻，-20℃靜置過夜；（3）4℃，15 000 r/min離心30 min，棄上清液；（4）加入-20℃預(yù)冷的提取溶劑Ⅱ（5.0 mL），渦旋振蕩1 min，充分混勻，-20℃靜置1 h；（5）4℃，15 000 r/min離心30 min，棄上清液；（6）重復(fù)步驟（4）、（5）2次；（7）加入-20℃預(yù)冷的蛋白質(zhì)提取液Ⅲ（5.0 mL），渦旋振蕩15 s；（8）4℃下15 000 r/min離心25 min，棄上清液；（9）-20℃靜置過夜，次日于-44℃真空冷凍干燥，即得魚腥草總蛋白質(zhì)干粉，于-20℃凍存、備用。

2.3 樣品溶劑制備

分別精密稱取各株所制得的蛋白質(zhì)干粉約40.0 mg于1.5 mL離心管中。用6×樣品緩沖液按1∶20（w／v）溶解，渦旋振蕩30 s，置水浴鍋37℃水浴1.5 h，4℃下13 000 r/m in離心25 min，取上清液置0.5 mL的滅菌離心管中再次離心，取上清液，依次分裝于滅菌EP管，-44℃冰箱儲存，即得。

2.4 蛋白質(zhì)含量測定

采用Ramagli改進(jìn)的Bradford［7-9］法測定，其操作步驟如下。

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取8支10 mL試管，2支做空白，其余6支分別加入1.0 mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mL，然后用去離子水補(bǔ)充至0.1 mL，最后各試管中分別加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，每加完一管，立即在漩渦混合器上混合2~5 min，依次測定吸光度（A595），每個(gè)標(biāo)樣重測3次實(shí)驗(yàn)，讀取其平均值；以吸光度值（y，A595）為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度（x）為橫坐標(biāo)進(jìn)行回歸，得回歸方程為：

表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白在0.1~1.0μg／μL濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.4.2 樣品測定

取待測樣品溶液15μL，用去離子水稀釋至100μL，加入5.0 mL Bradford工作液，渦旋混勻3～5 min后，測定樣品的A595，每個(gè)樣品重測3次，讀取其平均值代入上述回歸方程，即可求得各株魚腥草樣品的蛋白量濃度，最后折算成各株100 g魚腥草所含蛋白的量（見表1）。

表1 53株魚腥草蛋白含量測定結(jié)果 （%）

3 討論

3.1 蛋白質(zhì)提取方法分析及注意事項(xiàng)

魚腥草總蛋白的提取是進(jìn)行其總蛋白差異性、多樣性研究、魚腥草植物代謝網(wǎng)絡(luò)等系列研究的起點(diǎn)，因此適宜魚腥草鮮藥材總蛋白的提取方法甚為重要。由于不同物種不同器官或組織的化學(xué)組成不同，甚至同一植物不同組織其蛋白組成不同，所以其最適蛋白質(zhì)提取方法也不同。因此，目前還無一種能夠適用于所有植物不同物種和不同器官組織的普遍的提取蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)方法。本課題組在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中選用了［10-12］TCA-丙酮沉淀法、Tris法和磷酸緩沖液（PBS）法［13，14］對鮮魚腥草葉片總蛋白的提取進(jìn)行對比研究，從SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)TCA-丙酮沉淀法所獲得的蛋白條帶最多且清晰度最高，故認(rèn)為TCA-丙酮沉淀法較后兩者更適宜于魚腥草總蛋白的提?。辉僬?，魚腥草植物葉片中富含酚類、醌類及色素類物質(zhì)，它可以通過氫鍵等方式與蛋白質(zhì)結(jié)合，影響后續(xù)的研究工作。因此，在用液氮研磨組織葉片時(shí)，應(yīng)加入β-巰基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮（PVP），可以有效減少葉片中酚類、色素等干擾物質(zhì)。另外操作中還需注意：整個(gè)操作全過程應(yīng)需在冰上進(jìn)行，以防蛋白質(zhì)降解；所用的三氯乙酸和丙酮均應(yīng)事先制冷，提取時(shí)用80%冷丙酮少量多次反復(fù)洗滌沉淀；適量加大離心轉(zhuǎn)速和延長離心時(shí)間，均能有效除去多糖和鹽分等雜質(zhì)成分。

3.2 魚腥草總蛋白量差異性分析及討論

蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的產(chǎn)物，其種類和數(shù)量隨著機(jī)體、組織和細(xì)胞狀態(tài)的不同而不同。因此，從蛋白質(zhì)水平上系統(tǒng)全面地認(rèn)識中藥生長過程中的代謝合成途徑、代謝網(wǎng)絡(luò)以及與中藥質(zhì)量穩(wěn)定的關(guān)聯(lián)性問題，更能接近真實(shí)，更易揭示真相。故本文首先僅從魚腥草總蛋白質(zhì)（酶）量的差異性研究展開研究。

在蛋白質(zhì)測定方法方面：準(zhǔn)確測定每一植株魚腥草蛋白質(zhì)的量，找出其差異性是進(jìn)行蛋白多樣性研究的第一步。獲悉準(zhǔn)確的蛋白濃度也是把握電泳上樣量，獲得預(yù)期結(jié)果的保證。目前，蛋白濃度的測定方法很多，如紫外分光光度法（UV法）、Bradford法、BCA法、雙縮脲法、Lowry法和試劑盒法等，原理基本相似。本文采用Ramagli改進(jìn)的Bradford法［15］，此法較其他測定方法不易受Na+、K+、Mg2+、（NH4）2SO4、非蛋白質(zhì)復(fù)合物（如酚類）等因素的干擾；且操作簡便、反應(yīng)迅速和靈敏度較高，可保證蛋白濃度測定的準(zhǔn)確性。

在總蛋白差異性研究方面：中藥材的形成過程是伴隨生命現(xiàn)象的一個(gè)復(fù)雜的新陳代謝，因此在“5P”質(zhì)控模式下中藥材質(zhì)量仍因遺傳與變異規(guī)律使得其質(zhì)量個(gè)體間也必將存在一定程度上的差異，即個(gè)體間存在多態(tài)性或者多樣性。從表1結(jié)果可知，魚腥草各植株蛋白含量在1.766%～2.334%范圍間變化，其RSD為13.8%。說明即便同一GAP產(chǎn)地不同株植物仍然存在含量差異。也就是說總蛋白的株間差異性是存在的，欲知是否蘊(yùn)藏著總蛋白酶的差異，其蛋白酶的差異具體體現(xiàn)在種類上還是數(shù)量上，均需進(jìn)一步探討。本文僅從魚腥草蛋白的提取及含量測定及差異性進(jìn)行了研究討論，為后續(xù)研究奠定了一定基礎(chǔ)。

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