楊方園，關瑞章，2，3，李忠琴，2，3，于海振，李秋云

(1．集美大學水產(chǎn)學院，福建 廈門 361021;2．農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021;3．集美大學鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術教育部工程研究中心，福建 廈門 361021)

0 引言

花鰻鱺(Anguilla marmorata)為鰻鱺目(Anguilliformes)鰻鱺科(Anguillidae)鰻鱺屬(Anguilla)魚類，屬熱帶、亞熱帶江海洄游魚類，其分布范圍廣，國內(nèi)有長江及閩江下游等地;國外北達朝鮮南部及日本紀州，西達東非，東達南太平洋的馬貴斯群島，南達澳大利亞南部[1]．近年來由于自然水體污染嚴重及過度捕撈，花鰻鱺野生資源量急劇下降，1988年被我國列為國家Ⅱ級野生保護動物．花鰻鱺肉味鮮美，營養(yǎng)豐富，其脂肪和蛋白質(zhì)含量都很高，有滋補強壯之功效，為食用魚類中的珍品[2]．目前，國內(nèi)外關于花鰻鱺病害的研究較少，主要報道了花鰻鱺的基礎生物學、人工養(yǎng)殖模式及養(yǎng)殖技術等[3－5]，有關花鰻鱺的細菌性病原的研究未見報道．2012年5月，集美大學水產(chǎn)試驗場養(yǎng)殖的花鰻鱺發(fā)病，累計死亡率達到20%～25%．病鰻主要癥狀是鰓部嚴重腫脹，輕壓流出大量白色膿液，解剖后觀察鰓絲潰爛，肝臟失血，膽囊腫大，初步顯微觀察，發(fā)現(xiàn)病魚肝臟寄生大量細菌．因此，本研究擬對該病病原進行分離、鑒定及藥物敏感性試驗，以期為該病的防治提供參考依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

1)試驗材料 試驗用花鰻鱺取自位于廈門的集美大學水產(chǎn)試驗場．取癥狀明顯的病鰻用于病原分離與檢測;選體色正常、體表無損傷、活力良好、平均體重為(10±2)g的健康花鰻鱺用于人工感染試驗．

2)主要試劑 普通瓊脂、M－H培養(yǎng)基、胰酪胨大豆肉湯 (TSB)(上海博微生物科技有限公司);BUG Agar(美國BIOLOG公司);藥敏紙片 (杭州天和微生物試劑有限公司);DNA抽提試劑盒 (OMEGA BIO－TEK);GYZ－15eV發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌生化編碼鑒定管 (杭州天和微生物試劑有限公司)．

1.2 方法

1)細菌分離 取典型癥狀的病鰻，酒精棉擦拭魚體，無菌解剖鰓、肝臟以及腎臟組織，劃線接種于普通培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h后，挑取優(yōu)勢菌落重新劃線培養(yǎng)，挑取單菌落進一步純化培養(yǎng)，－80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫?/p>

2)人工感染試驗 取健康花鰻鱺隨機分組，每組10尾，水箱規(guī)格83 cm×55 cm×53 cm，水深30 cm，養(yǎng)殖試驗用水為曝氣的自來水，定時投食、充氣增氧和排污換水，養(yǎng)殖溫度控制在(27±2)℃．將從病鰻肝臟分離的優(yōu)勢菌株AMRB6接種于TSB肉湯中，28℃培養(yǎng)24 h，以涂布平板法測定的菌液濃度為1.0×109CFU/mL，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，共設定5個試驗組，感染劑量為每尾魚腹腔注射0.1 mL，同時設生理鹽水對照組．注射后從出現(xiàn)典型癥狀的花鰻鱺肝、腎部位進行細菌重分離并鑒定．試驗期間觀察并記錄各組鰻鱺的發(fā)病和死亡情況，試驗周期為14 d．根據(jù)Reed的方法[6]測定半數(shù)致死量．

3)生理生化特征檢測 將分離所得菌株劃線于普通培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h，檢查其生長情況及菌落特征，同時進行革蘭氏、芽孢染色．采用GYZ－15eV生化檢測試劑盒以及Biolog自動微生物鑒定系統(tǒng)，按照產(chǎn)品使用說明書對菌株進行鑒定．

4)16S rRNA序列測定 將菌株AMRB6接種于TSB肉湯中，30℃振蕩培養(yǎng)24 h，使用天根細菌基因組DNA提取試劑盒，提取細菌DNA作為PCR模板DNA．采用陳翠珍等[7]的方法進行細菌16S rRNA的擴增．PCR擴增后的產(chǎn)物純化后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進行基因序列測定．將菌株的16S rRNA序列與GenBank中的已知核酸序列進行比對，收集與該菌株同屬的其他菌株16S rRNA序列信息，采用DNA star 5.0和MEGA 5.0進行序列同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構建．

5)藥敏試驗 取培養(yǎng)物均勻涂布于M－H培養(yǎng)基平板上，貼上藥敏紙片 (杭州天和微生物試劑有限公司)，30℃培養(yǎng)24 h后測抑菌圈直徑，以抑菌圈直徑大小作為敏感與耐藥的判定指標[8]．

2 結果

2.1 細菌的形態(tài)

AMRB6菌株在30℃培養(yǎng)24 h后，普通瓊脂平板上呈現(xiàn)灰白色圓形、中央隆起菌落，邊緣整齊，表面濕潤、光滑，直徑約2 mm，革蘭氏染色為陰性、短桿狀、兩端鈍圓、無芽孢，大小多為(0.5～0.9)μm×(1.2～2.0)μm．

2.2 人工感染試驗

菌株AMRB6腹腔注射感染花鰻鱺在2 d后開始死亡，而對照組在14 d內(nèi)均正常 (見表1)．花鰻鱺的發(fā)病癥狀主要表現(xiàn)為體色變淺，下顎磨損出血，鰭條充血，鰓部嚴重腫脹，鰓粘液增多，肝臟失血，膽囊、腎臟輕微腫大，而對照組無癥狀出現(xiàn)．取人工感染后瀕死花鰻鱺病變組織接種，可回收得到AMRB6菌株，證明其為致病菌，對花鰻鱺的半數(shù)致死量為3.2×107CFU/mL．

表1 菌株AMRB6人工感染試驗Tab．1 Results of artificial infection test by bacterium AMRB6

2.3 菌株生理生化鑒定

菌株AMRB6有動力、氧化酶陰性、觸酶陽性、發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，能利用枸櫞酸鹽、ONPG、戊糖、山梨醇，不能利用賴氨酸、鳥氨酸、側金盞花醇等．其GYZ－15eV系統(tǒng)鑒定結果 (見表2)顯示，菌株AMRB6為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，鑒定結果可信度為86.13%．Biolog自動微生物系統(tǒng)鑒定結果顯示，AMRB6菌株為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，相似性為98.6%(見表3)．

表2 菌株AMRB6的GYZ－15eV系統(tǒng)鑒定結果Tab.2 Identification of bacterial AMRB6 by GYZ－15eV system

表3 菌株AMRB6的Biolog鑒定結果Tab．3 Results of Biolog identification of AMRB6

2.4 16S rRNA序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

對菌株AMRB6進行16S rRNA基因序列的測定，PCR擴增產(chǎn)物電泳結果如圖1所示．結果表明，菌株AMRB6的16S rRNA部分基因片段大小為1413 bp．將序列輸入GenBank進行Blast比對，并利用DNA Star軟件與GenBank中相似序列進行系統(tǒng)學分析，構建系統(tǒng)發(fā)育樹 (見圖2)，結果顯示其與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)(DQ010114)的同源性高于99%，二者在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一簇．綜合菌株AMRB6的生理生化特征以及16S rRNA基因序列分析結果，可以確定該菌株為弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，在GenBank中的登錄號是JX524616．

圖1 菌株AMRB616 SrRNA PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1 Agarose electrophoresis of 16S rRNA PCR products from the AMRB6

圖2 菌株AMRB6 16S rRNA序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequence of the AMRB6

2.5 藥敏結果

菌株AMRB6對左氧氟沙星、諾氟沙星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星、頭孢曲松等14種藥物高度敏感;對奧格門丁、多粘菌素B和頭孢他啶中度敏感;對利福平、氨芐西林、青霉素、復方新諾明、頭孢呋辛、頭孢克羅、哌拉西林等13種藥物耐藥 (見表4)．

3 討論

1)Biolog微生物鑒定系統(tǒng)是由美國BIOLOG公司推出的微生物鑒定系統(tǒng)，包括細菌、絲狀真菌和酵母在內(nèi)的2000多種微生物，數(shù)據(jù)庫容量大、鑒定范圍寬廣、實驗自動化及標準化程度高，目前已成為細菌分類鑒定中常用的技術手段之一[9]．杜昕波等[10]利用Biolog系統(tǒng)對13株大腸桿菌、15株巴氏桿菌和7株金黃色葡萄球菌進行鑒定，并與傳統(tǒng)的形態(tài)學、革蘭氏染色、生化測定等鑒定結果進行比對，結果表明Biolog系統(tǒng)具有準確、便捷等優(yōu)點．本研究運用Biolog系統(tǒng)鑒定菌株AMRB6為弗氏檸檬酸桿菌(C.freundii)，這與常規(guī)生理生化鑒定以及構建16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹得到的結果是一致的，從而證實Biolog微生物鑒定系統(tǒng)操作標準化、快速省時、準確，顯著優(yōu)于常規(guī)生理生化鑒定方法．

2)弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacter freundii)為腸桿菌科 (Enterobacteriaceae)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter Werkman and Gillen)細菌．檸檬酸桿菌在自然界廣泛分布，在人類胃腸道正常寄居，為機會致病菌[11]，其中弗氏檸檬酸桿菌在適宜的條件下可引起人體腦膜炎、骨髓炎、腹瀉、尿路感染、創(chuàng)面感染和敗血癥等[12－13];該菌亦可在一定條件下引發(fā)食物中毒，造成食源性污染[14－15]．近年來，關于檸檬酸桿菌導致水產(chǎn)動物患病死亡的研究也日益增多，林啟存等[16]報道了該菌引起中華鱉的出血性敗血癥，其主要癥狀為病鱉全身水腫，反應遲鈍，鰓腺發(fā)炎充血，肝臟腫大充血，腸黏膜脫落且腸道嚴重積水，腎臟點狀充血;陳翠珍等[17]報道弗氏檸檬酸桿菌是造成中華絨螯蟹病死的重要病原菌之一;沈錦玉等[18]報道了該菌引起紅螯螯蝦發(fā)病;李華等[19]首次報道了弗氏檸檬酸桿菌對河蟹的致病性以及感染后引起的病理變化 ，同時探究了該菌對藥物的敏感性及生產(chǎn)中藥物治療效果;Sanz[20]報道在美國由該菌引起的虹鱒感染發(fā)?。壳瓣P于弗氏檸檬酸桿菌對鰻鱺屬的危害還未見相關報道．本研究認為，弗氏檸檬酸桿菌是花鰻鱺的致病菌，可導致花鰻鱺鰭條充血，鰓部嚴重腫脹，鰓粘液增多等癥狀，人工感染試驗證實其對健康花鰻鱺有較強致病性．

3)根據(jù)藥敏試驗結果，分離菌對左氧氟沙星、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素等14種藥物高度敏感，對其他抗生素中度敏感或耐藥．據(jù)余德文[21]和劉明娟[22]的報道指出，不同菌株對藥物敏感性差別較大．因此通過藥敏實驗，可以有針對性地為以后選擇用藥提供相應的參考，以便準確有效地利用藥物進行治療．

表4 菌株AMRB6的藥物敏感性Tab．4 The antibiotic sensitivity of the bacterium AMRB6

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