楊 潔，武祥偉，3，劉賢德，2，謝仰杰，2，王志勇，2

(1.集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021;2.農(nóng)業(yè)部東海海水健康養(yǎng)殖重點實驗室，福建 廈門 361021;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

0 引言

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)技術(shù)是Vos等[1]于1995年建立的一種用途廣泛的分子標(biāo)記技術(shù)，它選擇性地擴(kuò)增連有人工接頭的酶切DNA片段，由于不同個體酶切位點存在差異而使酶切片段存在長度多態(tài)性.此技術(shù)無需預(yù)先知道基因組序列信息，理論上可以檢測到任何個體間的多態(tài)性，且具有可檢測片段多、重復(fù)性高等優(yōu)點，因此，在魚類群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[2]、親緣關(guān)系鑒定[3]、遺傳連鎖圖譜構(gòu)建[4]、分子標(biāo)記輔助選擇[5]等研究中被廣泛應(yīng)用.

AFLP檢測方法有多種，如同位素法[6]、銀染法[7]、熒光標(biāo)記法[8]等，其中銀染法是目前較常用的方法.銀染法具有靈敏度高、操作簡便、無放射性污染等優(yōu)點，但該法步驟較多，需時較長，慢速銀染法需要2～3 h[7]，快速銀染法也在0.5 h左右[9].熒光標(biāo)記AFLP技術(shù) (fAFLP)是近年來發(fā)展起來的一項AFLP分析檢測新技術(shù)，其基本原理是在一條或兩條選擇性擴(kuò)增引物的5’端標(biāo)記一種熒光素，如HEX、FAM等，用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在變性聚丙烯酰胺凝膠上分離時，熒光素經(jīng)激光照射激發(fā)出的熒光被捕捉到而成像，即可顯示出AFLP電泳條帶.此種方法無需進(jìn)一步顯色成像，電泳圖譜可使用計算機(jī)軟件分析并收集數(shù)據(jù)，因而效率較高.

鑒于fAFLP的優(yōu)越性，有必要將fAFLP技術(shù)應(yīng)用于大黃魚的遺傳分析，以取代傳統(tǒng)的AFLP技術(shù)，提高遺傳分析效率.為此，本文對影響fAFLP反應(yīng)的多個因子進(jìn)行了探索及優(yōu)化，以期建立大黃魚的fAFLP分析體系，為fAFLP在大黃魚遺傳研究中的應(yīng)用提供便捷的方法.

1 材料與方法

1.1 材料

大黃魚捕獲自福建省省寧德市官井洋海區(qū)，剪取部分鰭條，保存于95%(體積分?jǐn)?shù))酒精中用于基因組DNA抽提.Taq DNA聚合酶購自Takara生物工程 (大連)有限公司，EcoRⅠ與MseⅠ內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購自Fermentas生物工程公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純.使用的接頭及引物(見表1)由上海英駿生物工程公司合成.EcoRⅠ選擇性擴(kuò)增引物5'端標(biāo)記熒光素HEX.

表1 AFLP分析體系的引物序列Tab.1 Primer sequences of AFLP system

1.2 基因組DNA的抽提

采用傳統(tǒng)酚-氯仿法抽提基因組DNA[10]，用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測，并將其濃度調(diào)整至30 ng/μL，置于-20℃保存?zhèn)溆?

1.3 酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增

采用內(nèi)切酶EcoRⅠ與MseⅠ雙酶切基因組DNA，酶切片段連接對應(yīng)的接頭后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，以稀釋的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行選擇性擴(kuò)增.

設(shè)置4個基因組DNA濃度梯度:150、250、350、450 ng/μL，采用供應(yīng)商推薦的酶切溫度及濃度 (http://www.fermentas.com/cn/tools/doubledigest)進(jìn)行EcoRⅠ與MseⅠ雙酶切，取4 μL酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳檢測酶切效果.

設(shè)置6個內(nèi)切酶濃度 (EcoRⅠ與MseⅠ等量加入)梯度:0.05、0.1、0.15、0.25、0.35、0.45 U，消化350 ng基因組DNA 8 h，取4 μL酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳檢測酶切效果.

設(shè)置5個酶切時間:2、4、6、8、10 h，同時加入EcoRⅠ與MseⅠ內(nèi)切酶，每組的酶切溫度前面一半時間設(shè)為37℃，后面一半時間設(shè)為65℃.取4 μL酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳檢測酶切效果.

設(shè)置5個T4 DNA連接酶濃度梯度:0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 U，酶切產(chǎn)物3 μL與EcoRⅠ與MseⅠ接頭 (分別為4 nmol/μL與40 nmol/μL)在16℃下連接過夜，取4 μL連接產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳檢測連接效果.

設(shè)置10、20、30、50、100倍作為預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)梯度 (為減小偶然誤差，每梯度重復(fù)使用2個樣品)，使用E-AAC/M-CTC選擇性引物組合擴(kuò)增后進(jìn)行電泳檢測.

1.4 fAFLP體系的確立

按照AFLP操作步驟，采用單因素遞進(jìn)篩選方法 (前一步篩選的最優(yōu)結(jié)果作為下一步篩選的固定值)，依次對影響酶切、連接、預(yù)擴(kuò)增與選擇性擴(kuò)增的主要因子設(shè)置梯度優(yōu)化分析，確立最優(yōu)分析體系.

1.5 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

電泳在遺傳分析儀GelScan 3000上進(jìn)行，操作程序參照文獻(xiàn) [11]的報道:PCR產(chǎn)物中加入1/6體積的6×Loading Buffer，95℃變性5 min后迅速置于冰上，取1 μL在5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))變性聚丙烯酰胺凝膠 (19∶1)上電泳.以GenScanTM-500 TAMRATMSize Standard作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，電泳完畢后保存掃描圖像，并使用ONE DScan software分析統(tǒng)計數(shù)據(jù).

2 結(jié)果

2.1 影響大黃魚fAFLP的因素

1)基因組DNA濃度 采用供應(yīng)商推薦的酶切溫度及Buffer濃度 (http://www.fermentas.com/cn/tools/doubledigest)，按4個基因組DNA濃度:150、250、350、450 ng/μL，進(jìn)行EcoRⅠ與MseⅠ雙酶切.取4 μL酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳，其結(jié)果 (見圖1)顯示，酶切片段集中在100～1500 bp之間，基因組DNA為350ng時酶切產(chǎn)物電泳條帶最亮，酶切最充分.

2)內(nèi)切酶濃度 6個內(nèi)切酶濃度 (EcoRⅠ與MseⅠ等量加入)的酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果 (見圖2)顯示，內(nèi)切酶濃度越大，條帶越亮，酶切越充分.因此，EcoRⅠ與MseⅠ各0.45 U較合適.

圖1 模板DNA濃度對酶切的影響Fig.1 Effect of genomic DNA concentration on enzyme digestion reaction

圖2 內(nèi)切酶濃度對酶切反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on digestion reaction

3)酶切時間 不同酶切時間的酶切產(chǎn)物在1.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上的電泳結(jié)果 (見圖3)表明，8 h與10 h時酶切片段分布較集中，電泳條帶亮，酶切充分，因而8～10 h酶切均為合適.

4)連接酶濃度 5個濃度的T4 DNA連接酶的連接效果 (見圖4)顯示，T4 DNA連接酶為1.5U與2.5U時目標(biāo)電泳條帶最明亮，連接最充分.因此，連接酶為1.5～2.5 U時均合適.

圖3 酶切時間對酶切的影響Fig.3 Effect of digestion time on digestion reaction

圖4 連接酶濃度對連接反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of ligase concentration on ligation

5)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋倍數(shù) 把預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10、20、30、50、100倍，以此分別作為PCR模板，使用E-AAC/M-CTC選擇性引物組合擴(kuò)增，由電泳圖譜 (見圖5)可知，前4個稀釋梯度下擴(kuò)增效果無明顯差異，但當(dāng)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍時，1個樣品的某些電泳條帶缺失，與其他樣品的電泳圖譜相比有明顯差異.因而，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋超過100倍時會影響選擇性擴(kuò)增.

圖5 預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物稀釋倍數(shù)對選擴(kuò)的影響Fig.5 Effect of dilution times on selective amplification

2.2 fAFLP體系的確立

依據(jù)上述實驗結(jié)果，建立了一套大黃魚fAFLP分析體系:

1)酶切體系:4 μL 10 × Buffer Tango，0.45 μL EcoRⅠ (10 U/μL)，0.45 μL MseⅠ (10 U/μL)，7 μL DNA(50 ng/μL)，加雙蒸水至 20 μL.反應(yīng)程序:37℃ 4 h，65℃ 4 h，80℃滅活20 min.

2)連接體系:1.5 μL T4 Buffer，0.8 μL EcoRⅠ 接頭(5 μmol/L)，0.8 μLMseⅠ 接 頭 (50 μmol/L)，2.5 μL T4 DNA連接酶 (1 U/μL)，3 μL 酶切產(chǎn)物，加雙蒸水至15 μL.反應(yīng)程序:16℃連接過夜 (大于10 h).

3)預(yù)擴(kuò)增體系:2 μL 10 × PCR Buffer，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.5 μL EcoRⅠ-A(10 μmol/L)，0.5 μL MseⅠ-C(10 μmol/L)，0.2 μL Taq DNA聚合酶 (5 U/μL)，1 μL連接產(chǎn)物，加雙蒸水至20 μL.PCR 反 應(yīng) 程 序:95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 50 s(20個循環(huán))，72℃ 15 min.

4)選擇性擴(kuò)增體系:2 μL 10 × PCR Buffer，1.2 μL MgCl2(25 mmol/L)，0.4 μL dNTPs(10 mmol/L)，0.6 μL EcoRⅠ引物 (10 μmol/L)，0.6 μL MseⅠ引物 (10 μmol/L)，0.2 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)，2 μL 預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物(稀釋 50倍)，加雙蒸水至 20 μL.PCR反應(yīng)程序:

95℃5min，95℃ 30 s、65～56℃ (每循環(huán)降低1℃)30 s、72℃ 50 s(9個循環(huán))，95℃ 30 s、56℃ 30 s、72℃ 50 s(28個循環(huán))，72℃ 15 min.

2.3 大黃魚群體fAFLP片段多態(tài)性分析

采用上述實驗結(jié)果確立的fAFLP分析體系，使用選擇性擴(kuò)增引物組合E-AGG/MCTT，分析了24尾野生大黃魚AFLP片段的多態(tài)性水平.電泳圖譜共檢測到60條清晰可辨的AFLP條帶，其中多態(tài)性條帶41條(見圖6)，多態(tài)比例為68.3%.使用 ONE DScan軟件分析電泳圖譜，圖7為泳道1目的條帶的波峰圖，由圖7可見檢測到的信號強(qiáng)，波峰明顯.

圖6 選擇性擴(kuò)增引物(E-AGG/M-CTT)的fAFLP電泳圖譜Fig.6 Electrophoresis pattern of fAFLP using selective primers E-AGG/M-CTT

圖7 fAFLP電泳圖譜中泳道1的波峰圖Fig.7 Wave picture of the first lane of fAFLP

3 討論

酶切是AFLP分析成功的基礎(chǔ)，酶切完全與否直接影響AFLP可檢測到的多態(tài)性水平，也影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性.影響酶切的內(nèi)因主要是內(nèi)切酶用量.本研究中，一定范圍內(nèi)酶切產(chǎn)物隨著內(nèi)切酶用量的增加而逐步增多，說明酶切越來越充分;且內(nèi)切酶用量不超過反應(yīng)體積的1/10，既保證了酶切的高效性與特異性，又降低了實驗費用[12].影響酶切的外因主要是酶切時間，時間不足，酶切不充分，易出現(xiàn)假陰性擴(kuò)增結(jié)果;時間過長，內(nèi)切酶可能產(chǎn)生新的活性，因而它是酶切的一個關(guān)鍵點.本研究中，隨著酶切時間延長，酶切片段長度逐漸變小，電泳條帶亮度逐步增加，酶切已達(dá)到充分狀態(tài)，同時為了防止內(nèi)切酶產(chǎn)生新的酶切活性，本研究選擇酶切8 h.此外，AFLP分析中酶切基因組DNA的量也是影響酶切效果的外因.基因組DNA量較多時，不僅需要更多的內(nèi)切酶，而且易導(dǎo)致酶切不充分.本研究首先使用內(nèi)切酶供應(yīng)商提供的酶切溫度等條件設(shè)置梯度對基因組DNA用量進(jìn)行優(yōu)化，當(dāng)酶切350 g大黃魚基因組DNA時既能達(dá)到充分的酶切效果，又能得到較理想的酶切片段大小.

本研究中，當(dāng)預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍時其中1個樣品的某些電泳條帶缺失，與其他樣品相比電泳圖譜差異明顯.這是由于模板濃度過低致使PCR產(chǎn)物量少，不易檢測到電泳條帶的信號[13].但同時，也為了避免模板濃度過高而產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，本研究選擇稀釋50倍的預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物作為選擇性擴(kuò)增的模板.接頭連接效率也是AFLP分析中的重要一環(huán)，直接影響預(yù)擴(kuò)增的效果.連接酶用量是連接效率的主要影響因素，本研究中，當(dāng)連接酶用量為1.5 U與2.5 U時目標(biāo)電泳條帶最明亮，連接最充分.

早期的DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳是應(yīng)用放射性核素標(biāo)記完成的[6]，但該方法操作不便，而且可使用范圍局限于少數(shù)具有放射性核素設(shè)施的單位.后來主要使用銀染法[7]，該方法克服了放射性核素標(biāo)記法的缺點，但銀染法耗時較長，顯色效果有時較難把握，當(dāng)AFLP片段大小相差較小時常顯示為一條粗亮的條帶，難以區(qū)分;銀染法還需從膠板人工讀取數(shù)據(jù)，工作繁瑣，受人的主觀性與誤判影響導(dǎo)致的誤差大.熒光法僅標(biāo)記PCR產(chǎn)物的單鏈，不帶標(biāo)記的反向單鏈不會被檢出，1個等位基因通常只顯示唯一一條清亮的條帶，彌補(bǔ)了銀染法等存在的上述不足.因此，fAFLP不僅能夠進(jìn)行自動化檢測、讀數(shù)，解決了操作繁雜、工作量大的問題，而且其靈敏度高，擴(kuò)增量很低的AFLP片段也能很好地被檢測到，擴(kuò)增了可檢測的信息量[14-15]，在分析大量樣本時fAFLP能夠?qū)崿F(xiàn)對全基因組快速掃描，最大程度上降低系統(tǒng)誤差，是一種安全、高效的檢測方法.正因為如此，本研究在24尾大黃魚樣品中檢測到清晰可靠、多態(tài)性高的AFLP條帶.

fAFLP分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合了RFLP技術(shù)的可靠性、PCR技術(shù)的高效性，以及熒光標(biāo)記技術(shù)的靈敏性與準(zhǔn)確性，具有信息量大，呈孟德爾遺傳等特點，且無需預(yù)先掌握目標(biāo)生物的遺傳背景，因此得到越來越多研究人員的青睞，已大量應(yīng)用在海洋生物遺傳多態(tài)性研究中.彭永興等[16]采用fAFLP方法分析了簾蛤科中4個養(yǎng)殖蛤群體的遺傳多樣性水平，6對EcoRⅠ與MseⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合在128個個體中擴(kuò)增得到1096個片段，每對引物組合檢測到的多態(tài)性比率均在92%以上.邵艷卿等[17]采用同樣的方法分析了3個蟶群體共60個個體的遺傳多態(tài)性水平，5對EcoRⅠ與MseⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合擴(kuò)增出781個片段，每對引物組合檢測的多態(tài)性比率在51% ～93%之間.Michelle等[18]采用fAFLP方法分析了2個南美白對蝦(Litopenaeus vannamei)品系共30個個體的遺傳多樣性水平，2對EcoRⅠ與MseⅠ選擇性擴(kuò)增引物組合分別檢測到48個與45個多態(tài)性片段.本研究使用1對選擇性擴(kuò)增引物檢測了一個野生大黃魚群體的多態(tài)性，多態(tài)比例與已發(fā)表的官井洋野生群體AFLP多態(tài)性水平(69.2%)[19]相當(dāng)，高于岱衢族野生群體的AFLP多態(tài)性水平 (55.08%)[20].因此，本文的fAFLP方法完全適合進(jìn)行群體遺傳多態(tài)性分析.

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